目的探究芎归方活性成分阿魏酸(Ferulic acid,FA)对小胶质细胞和星形胶质细胞的相互作用能否发挥抗炎作用,为缺血性卒中治疗提供细胞分子学理论基础。方法1.使用LPS干预BV2构建体外炎症模型,收集BV2条件培养液(Conditioned medium,CM),用LPS、FA、CM对C8D1A进行干预,分组为:CON组、LPS组、LPS+FA组、LPS-CM组、LPS-CM+FA组。CCK8检测FA各浓度干预星形胶质细胞的安全浓度范围;qRT-PCR检测星形胶质细胞促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)、抗炎因子(TGF-β、IL-4、IL-10)和表型基因(C3、S100A10)的表达变化。2.收集LPS干预后的BV2条件培养液,超速离心后获得无外泌体条件培养液(Exosome free conditioned medium,EFCM)和外泌体(Exosome,EXO),用FA、EFCM和EXO对C8D1A进行干预,分组为:(1)无外泌体条件培养液组:CON组、CON-EFCM组、LPS-EFCM组、CON-EFCM+FA组、LPS-EFCM+FA组;(2)外泌体组:CON组、CON-EXO组、LPS-EXO组、CON-EXO+FA组、LPS-EXO+FA组。超离提取的外泌体再进行纳米粒径、透射电镜和蛋白鉴定。CCK8检测小胶外泌体各浓度(5、10、20ug/m L)干预星形胶质细胞的安全浓度范围。qRT-PCR检测星形胶质细胞促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)、抗炎因子(TGF-β、IL-4、IL-10)和表型基因(C3、S100A10)的表达变化。3.将LPS和FA直接作用于小胶质selleck HPLC细胞获得小胶质细胞EFCM及EXO,再对星形胶质细胞进行干预,分组为:(1)无外泌体条件培养液组:CON组、CON-EFCM组、LPS-EFCM组、LPS+FA-EFCM组;(2)外泌体组:CON组、CON-EXO组、LPS-EXO组、LPS+FA-EXO组。qRT-PCR检测星形胶质Medical research细胞促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)、抗炎因子(TGF-β、IL-4、IL-10)和表型基因(C3、S100A10)的表达变化。4.将LPS和FA干预的BV2-EXO作用于C8D1A,分组为:CON组、CON-EXO组、LPS-EXO组、LPS+FA-EXO组。免疫荧光染色观察FA诱导BV2-EXO对星形胶质细胞NFAT/NF-κB通路的影响。结果1.CCK8结果显示,FA在(25-100)m M范围内对LPS干预的C8D1A细胞没有药物毒性。qRT-PCR结果表明,从炎症基因来看,LPS与小胶质细胞LPS-CM均可诱导星形胶质细胞促炎基因表达上升,且小胶质细胞LPS-CM对星形胶质细胞产生的促炎效应比LPS直接干预星形胶质细胞带来的促炎效应要强。FA对LPS造成的星形胶质细胞促炎效应没有明显抑制,而对LPS-CM造成的星形胶质细胞促炎效应具有明显抑制作用。与LPS-CM组相比,LPS-CM+FA组抗炎基因表达均上升。从表型上来看,LPS与小胶质细胞LPS-CM均可诱导星形胶质细胞转化为A1促炎表型,符合促炎基因表达结果,且FA对LPS-CM诱导的A1表型转化具有明显抑制作用。LPS对A2表型没有明显抑制作用,但LPS-CM对A2表型具有明显抑制作用。2.CCK8结果显示10ug/m L的小胶质细胞外泌体对星形胶质细胞活性无明显影响。qRT-PCR结果显示,LPS-EFCM与LPS-EXO对星形胶质细胞的促炎因子均具有明显上调作用,其中FA对LPS-EFCM带来的促炎效应具有抑制作用,而对LPS-EXO来的促炎效应无明显抑制作用。而EFCM与EXO各组对抗炎因子的表达均无明显影响。相对应的,LPS-EFCM与LPS-EXO均能促进星形胶质细胞向A1表型转化,FA对LPS-EFCM具有抑制作用,但FA对LPS-EXO带来的A1表型转化无抑制作用。FA对A2表型转化都无明显影响。3.qRT-PCR结果Panobinostat价格显示,LPS-EFCM与LPS-EXO作用于星形胶质细胞均能使其促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达升高,并且LPS+FA-EFCM与LPS+FA-EXO都能抑制促炎因子的上升,但是LPS+FA-EXO对LPS-EXO IL-1β的抑制作用不明显。就抗炎因子来说,LPS+FA-EFCM能提高IL-4的表达,但对TGF-β、IL-10无明显作用。而LPS+FA-EXO均能提高星形胶质细胞TGF-β、IL-10、IL-4的表达。就表型来说,LPS-EFCM与LPS-EXO都能实现星形胶质细胞向A1表型的转化,且LPS+FA-EFCM与LPS+FA-EXO能抑制星形胶质细胞向A1转化。但CON-EFCM与LPS-EFCM均抑制了A2表型的表达,LPS+FA-EFCM能缓解LPS-EFCM对A2表型的抑制。而外泌体组的CON-EXO与LPS-EXO对A2表型没有抑制作用,且LPS+FA-EXO能显著促进星形胶质细胞向A2转化。4.免疫荧光结果显示,LPS-EXO可促进NF-κB和NFATc3入核,LPS+FA-EXO可抑制NF-κB入核,但并不能抑NFATc3入核。结论1.FA可有效抑制LPS及小胶质细胞LPS-CM刺激星形胶质细胞造成的炎症效应,抑制A1表型转化。2.FA对LPS-EFCM发挥的治疗效应是在星形胶质细胞环节起作用,对EXO发挥的治疗效应是在小胶质细胞环节起作用。3.FA诱导小胶质细胞分泌的外泌体能使星形胶质细胞NF-κB核异位,NFATc3无明显核异位。