牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是黄病毒科瘟病毒属的一种正链RNA病毒,是牛病毒性腹泻的病原。BVDV对养牛业造成了巨大的影响和经济损失,利用抗病毒药物是预防新生犊牛感染的一个有吸引力的策略。然而,目前很少有抗病毒药物可以预防BVDV感染。植物黄酮醇槲皮素对人类和动物具有多种促进健康和免疫调节作用,具备作为抗病毒药物的潜力。热休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)作为最丰富和最典型的HSP之一,在黄病毒科病毒感染中扮演着重要角色,被认为免疫逃逸背景下病毒调节的逻辑靶点。槲皮素能抑制各种细胞中HSP的合成,然而槲皮素能否通过调控HSP70的表达进而抑制BVDV病毒复制,尚不清楚。因此,本研究旨评价槲皮素通过调控HSP70对BVDV病毒体内外复制的影响,并阐明其作用机制。首先,研究MDBK细胞中HSP70对BVDV(CP/NCP)复制的影响。分别构建HSP70过表达慢病毒和HSP70 siRNA,转染至MDBK细胞后验证过表达和敲低情况。而后将MDBK细胞感染BVDV(CP/NCP),分别于12 h、24 h、48 h检测过表达、敲低HSP70对BVDV病毒复制的影响。结果表明,成功构建了过表达HSP7Chengjiang Biota0慢病毒。MDBK细胞中,慢病毒介导HSP70过表达能够促进BVDV(CP/NCP)病毒复制,并且随着时间的延长,HSP70和病毒的mRNA、蛋白表达量也相对增加(P<0.05)。其中,CP型BVDV的病毒表达水平显著高于NCP型BVDV(P<0.05)。利用HSP70 siRNA可成功干扰MDBK细胞中HSP70表达,同时抑制HSP70可抑制BVDV(CP/NCP)复制。然后,研究MDBK细胞中槲皮素调控HSP70对BVDV病毒复制的分子机制。首先鉴定槲皮素对HSP70和BVDV(CP/NCP)的影响。利用分子对接和蛋白热迁移试验鉴定槲皮素与BVDV蛋白之间的互作,并通过CCK8检测槲皮素对MDBK细selleckchem LEE011胞活性影响。而后将槲皮素对MDBK细胞进行预处理和后处理,分别感染BVDV(CP/NCP),检测HSP70和BVDV的mRNA和蛋白水平,并通过TCID_(50)检测槲皮素介导HSP70的抗病毒活性。结果表明,槲皮素可与NADL-E2结合具有稳定的结合作用。MDBK细胞中槲皮素安全浓度范围为20-100μmol/L,感染BVDV(CP/NCP)后,TCID_(50)随着槲皮素浓度的增加而逐渐降低(P<0.05)。经过预处理的MDBK细胞中HSP70、BVDV mRNA和蛋白水平显著低于后处理组(P<0.05)。其次,本研究检测MDBK细胞中槲皮点击此处素/HSP70 siRNA对抗氧化基因及氧化应激影响。利用槲皮素和HSP70 siRNA处理MDBK细胞后分别感染BVDV(CP/NCP),检测氧化应激和抗氧化基因相应指标。结果表明,CP型BVDV能够明显的刺激MDBK细胞中ROS的产生。利用槲皮素和HSP70 siRNA处理MDBK细胞,可显著减少CP型BVDV诱导产生的ROS。槲皮素可促进MDBK细胞内抗氧化基因的表达并减少MDA的产生,同时促进抗氧化酶的表达。再次,本研究检测槲皮素/HSP70 siRNA对ERK通路的影响,将槲皮素和HSP70 siRNA处理MDBK细胞,并感染BVDV(CP/NCP)检测ERK/P-ERK表达情况。结果表明,槲皮素和HSP70 siRNA可抑制CP型BVDV诱导的ERK磷酸化,同时抑制病毒复制。最后,研究槲皮素对BVDV急性感染小鼠的保护作用。利用不同浓度槲皮素处理BVDV模型小鼠,通过临床观察、病毒载量、HSP70表达量、IFN-γ和IL-2的表达水平、抗氧化基因、氧化应激及抗氧化酶指标进行检测,并进行病理组织学分析。结果表明,槲皮素能够降低BVDV急性感染小鼠体内的病毒载量并抑制HSP70表达、缓解BVDV引起的免疫抑制和脾脏以及十二指肠的病理组织损伤。槲皮素可促进体内抗氧化基因(HO-1、NQO-1、Nrf2)表达、抑制氧化应激ROS和MDA,同时促进抗氧化酶(T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-PX)的表达。综上所述,HSP70高表达有利于BVDV复制。槲皮素既能够与BVDV-NADL-E2蛋白稳定结合,又可在病毒感染早期抑制HSP70的表达和BVDV(CP/NCP)的复制。利用槲皮素和HSP70 siRNA可显著减少CP型BVDV诱导产生的ROS。同时,槲皮素可提高MDBK细胞的抗氧化应激水平,并通过调控HSP70水平影响CP型BVDV诱导的ERK/P-ERK表达。此外,槲皮素能够减少BVDV急性感染小鼠体内的病毒载量,缓解BVDV引起的免疫抑制和脾脏以及十二指肠的病理组织损伤、提高小鼠的抗氧化应激能力。因此,本研究为探索槲皮素调控HSP70表达对BVDV复制和宿主细胞氧化应激的作用机制提供了基础数据,同时为抗BVDV感染靶点药物治疗提供了新策略。