4,6-α-葡聚糖转移酶(4,6-α-Gtf,EC 2.4.1.-)是近些年发现的新型转苷酶,可转化淀粉合成富含α-1,6键的低热量糊精,有望代替传统麦芽糊精应用于食品加工。本实验室前期已鉴定Bacillus sporothermodurans来源的4,6-α-Gtf(Bs Gtf)和LimosiJQ1lactobacillus fermentum NCC 3057来源的4,6-α-Gtf(Lf Gtf)。其中Bs Gtf制备的低热量糊精α-1,6键含量为同亚家族最高,即抗性最高;Lf Gtf制备的低热量糊精具有分子量低、可溶性好的特点。Bs Gtf和Lf Gtf制备低热量糊精各具优势,但均存在最适温度低、热稳定性差、可溶性表达量低的问题,限制了其工业应用。针对上述问题,本论文以Bs Gtf和Lf Gtf为研究对象,通过理性设计和定向进化等方式,对Bs Gtf和Lf Gtf的热稳定性进行改造;通过对末端序列截短以及表达元件优化,在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中对Bs Gtf和Lf Gtf进行重组表达研究;最后,通过对比不同蛋白酶基因敲除宿主及发酵条件优化,对Bs Gtf和Lf Gtf优势突变体表达菌株进行摇瓶和3-L罐发酵水平研究。主要研究结果如下:(1)Bs Gtf的热稳定性改造。首先,采用多序列比对、表面电荷优化和定向进化策略对Bs Gtf进行热稳定性改造,共获得8个热稳定性提高的突变体。其次,采用迭代组合的方式进行组合突变,获得了具有协同效应的6个突变体组合E110P/S209＿K210ins P/D30K/E31I/K327E/K328E/G331S/L333K/S405N/N406D/E407L/E408N/K455P,命名为CMⅥ。与野生型相比,CMⅥ最适温度提高10℃(55℃),T_m提高12.01℃(64.5℃),在50℃条件下半衰期(t_(1/2))提高16.4倍(144.4 min)。然后,通过分子动力学模拟(MD),结果表明CMⅥ的RMSD、SASA值比野生型明显降低,说明CMⅥ整体结构紧凑,刚性增强。结构分析表明表面电荷优化是提高CMⅥ热稳定性的主要原因。最后,在50℃条件下,分别利用野生型和优势突变体制备低热量糊精,优势突变体酶转化产物中抗性成分含量是野生型的1.46倍,说明优势突变体在高温条件下具有更好的应用效果。(2)Lf Gtf的热稳定性改造。首先,借助计算机辅助设计、同源序列比对和定向进化策略对Lf Gtf的Loop区域进行改造,共获得11个热稳定性提高的突变体。其次,采用迭代组合的方式进行组合突变,获得了具有协同效应的9个突变体组合Y134V/Y241P/N247P/D420P/A473P/T517M/M765L/L777P/S813P,命名为CM9。与野生型相比,CM9最适温度提高5℃(50℃),T_m提高5.8℃(59.5℃),在50℃条件t_(1/2)提高12.0倍(330.1 min)。然后,通过MD分析了CM9结构变化,结果表明CM9的RMSD、SASA值较野生型明显降低,说明CM9整体结构紧凑,刚性增强,其中最为显著的是酶表面三个Loop区域的摆动幅度明显降低,这些均有利于CM9热稳定性提高。最后,在50℃条件下,分别利用野生型和优势突变体制备低热量糊精,其中优势突变体酶转化产物中抗性成分含量是野生型的1.43倍,说明优势突变体在高温条件下具有更好的应用效果。(3)Bs Gtf在B.subtilis中重组表达。首先,通过MD模拟发现对Bs Gtf的C端截短158个氨基酸后,突变体BsΔGtf_(1-705)(简称BsΔGtf)结构最稳定。将其在B.subtilis中重组表达,酶活性是对照的3.4倍。其次,从11个内源性启动子中筛选出最优单启动子P_(npre),并与其它启动子串联组合,最终确定双启动子P_(hag-npre)最有利于BsΔGtf重组表达,酶活性是对照4.83倍。在此基础上,通过信号肽筛选,发现信号肽SP_(ywe A)效果最显著,酶活性是对照的1.41倍。将上述的策略引入热稳定性提高的突变体(BsΔm Gtf)进行重组表达,其酶活性达到1035.9 U·m L~(-1),是优化前的24.84倍。然后,在3-L罐体系中发酵验证BsΔm Gtf的重组表达效果,确定BsΔm Gtf适合于3-L罐大体系发酵。其次,通过验证敲除不同蛋白酶基因的B.subtilis宿主WS8-WS11,最终确定敲除六种蛋白酶基因(Δnpr B,Δmpr,Δbpr,Δepr,Δapr E和Δnpr E)的宿主菌WS9最有利于BsΔm Gtf重组表达,摇瓶发酵酶活性是1204.1 U·m L~(-1)。最后,对摇瓶发酵培养中重要成Gefitinib-based PROTAC 3分及参数进行优化,重组菌WS9BM的胞外BsΔm Gtf酶活性达到3556.5 U·m L~(-1),是优化前的2.9倍。在此基础上,对3-L罐发酵条件优化,确定BsΔm Gtf在重组菌中最优表达条件。在3-L罐中发酵,重组菌WS9BM胞外BsΔm Gtf酶活性达到36232.8 U·m L~(-1),是优化前的3.0倍。(4)Lf Gtf在B.subtilis中重组表达。首先,根据基因的m RNA 5′-端序列发卡结构自由能越大越有利于翻译的原则。对Lf Gtf的N端68个氨基酸进行截短获得突变体LfΔN_(69-949)Gtf(简称LfΔGtf),在B.subtilis中重组表达酶活性是对照的3.1倍。其次,从11个内源性启动子中筛选出最优单启动子P_(ahp F),并与其它启动子串联组合,最终确定双启动子P_(amy Q-ahp F)最有利于LfΔGtf重组表达,酶活性是对照的13.7倍。将上述策略引入热稳定性最优突变体(LfΔm Gtf)进行重组表达,其酶活性达到1194.1 U·m L~(-1),是优化前的54.28倍。然后,添加化学分子伴侣海藻糖进一步强化其重组表达。MD结果表明海藻糖分子结合在4,6-α-Gtf的特定区域,进而稳定了局部构象,最终提高重组酶在发酵环境中的稳定性,这可能是可溶性表达提高的原因。最后对LfΔm Gtf的重组菌发酵体系进行放大,经过多策略优化,LfΔm Gtf在重组菌WS9dual-phenotype hepatocellular carcinomaLM 3-L罐水平的酶活性仅为摇瓶的30.3%,其原因有待进一步研究。