目的:多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种T细胞介导的中枢神经系统(central nervous ssystem,CNS)自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是目前最常见的用来研究MS的动物模型。黄芩的主要成分黄芩素(Baicalein,BAI)是一种膳食补充剂,已被证明具有抗炎、神经保护和免疫调节等作用。本研究探讨BAI对EAE小鼠的保护作用及其相关机制。方法:1.将20只C57BL/6雌性小鼠随机平均分成4组:Control组、EAE组、EAE+BAI组、EAE+DEX组。通过体重记录、神经功能评分、病理切片染色和免疫荧光技术等方法检测各组小鼠脊髓组织炎性细胞浸润和脱髓鞘程度。2.通过免疫荧光技术检测各组小鼠脊髓组织中i NOS、Iba-1和Arg1的表达情况。通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测各组小鼠脊髓组织中i NOS、CD86、IL-18、IL-12p35以及IL-12p40的m RNA表达水平。通过Western blot检测各组小鼠脊髓组织中Iba-1和i NOS的蛋白表达以及BAI对小鼠脾脏和RAW264.7细胞中STAT1活化情况。通过流式细胞术和小鼠M1巨噬细胞试剂盒检测各组小鼠脊髓组织/RAW264.7细胞系上清液中M1型相关炎性因子分泌。3.通过计算机模拟分子对接、pull-down、Western blot和免疫荧光方法检测BAI与STAT1是否具有结合能力以及BAI对M1极化过程中的巨噬细胞pSTAT1信号转导的影响。4.通过流式细胞术和q RT-PCR分别检测BAI干预后EAE模型小鼠体内Th1/17细胞群比例及其相关细胞因子的表达水平。通过Western blot检测JAK/STATs信号通路的相关蛋白和相关促炎因子蛋白表达。最后通过计算机模拟分子对接、pull-down、Western blot和免疫荧光方法检测BAI与STAT1/3是否具有结合能力以及BAI对p-STAT1/3信号转导的影响。结果:1.EAE+BAI组与EAE组相比,发病时间延后,病理损伤较轻,并且体重下降趋势明显改善。2.与EAE组相比较,EAE+BAI组小鼠脊髓组织中Iba-1阳性小胶质细胞数量显著减少,且i NOS表达减弱。EAE+BAI组小鼠脊髓组织中i NOS、CD86、IL-12p35、IL-12p40和IL-18的m RNA水平均显著低于EAE组。与EAE组相比,EAE+BAI组小鼠脊髓组织中Iba-1和i NOS蛋白表达显著降低。EAE组小鼠脊髓中CXCL1、IL-12p70和IL-18的分泌显著增加,而在EAE+BAI组小鼠脊髓中显著减少。体外结果表明,BAI干预后Adavosertib半抑制浓度,均能明显抑制由LPS导致的细胞形态学改变。流式结果显示,BAI干预后,CD86的平均荧光强度和百分比的明显下调。并且抑制了LPS诱导的促炎因子的分泌。3.在体medication-induced pancreatitis内实验中,p-STAT1在EAE小鼠的脊髓组织中表达上调,但在BAI治疗的EAE小鼠中显著下调。体外实验结果表明,LPS和IFN-γ共刺激能使RAW264.7细胞中p-STAT1显著增加,BAI干预后可明显降低LPS和IFN-γ诱导的STAT1蛋白的磷酸化水平。分子对接,pull-down和共定位实验结果表明BAI与STAT1具有结合作用,并且在RAW264.7细胞中抑制了p-STAT1核转位。4.本研究发现BAI可明显降低体内Th1和Th17细胞群的比例,同时BAI降低EAE小鼠脊髓中IFN-γ和TNF-α的m RNA和蛋白表达水平以及IL-KPT-33017A的m RNA表达水平。EAE组小鼠脾细胞中p-STAT1和p-STAT3蛋白表达显著升高,经BAI治疗后蛋白水平明显下降。进一步研究表明,在EAE+BAI组,转录因子T-bet和RORγt的转录水平也显著降低,这可能是由于BAI抑制了JAKSTAT1介导的Th1分化以及JAK-STAT3介导的Th17分化造成的。通过分子对接、pull-down和免疫荧光实验证实,BAI具有靶向结合STAT1/3的能力,并且使p-STAT1/3停留在细胞质中,阻碍JAK/STATs信号的转导,从而抑制Th1/17细胞分化和介导的炎症反应。结论:综上所述,通过BAI治疗后,EAE小鼠的临床症状和病理变化得到明显改善,并且BAI有效地减少了激活的小胶质细胞/巨噬细胞的数量,并抑制其向M1型极化。此外,BAI抑制了Th1和Th17细胞的炎性因子分泌。BAI对EAE小鼠的症状改善作用一方面可能通过靶向STAT1抑制EAE小鼠小胶质/巨噬细胞向M1极化,另一方面可能通过靶向STAT1/3抑制EAE小鼠Th1和Th17炎症反应对EAE小鼠发挥保护作用。