背景:牙周炎(periodontitis)是一种由菌斑微生物感染引起的牙周组织慢性炎症性破坏性疾病,会导致牙周组织不可逆转的损伤,最终可造成牙齿松动甚至脱落。我国是牙周病高发的国家,第四次全国口腔健康流行病学调查资料显示:中年和老年人群牙周健康者分别仅为9.1%和5.0%,由牙周病对个人带来的疾病负担以及其所造成的社会经济负担随着我国进入人口老龄化,将日益严重。当前,牙周炎的治疗以机械治疗为主,药物治疗为辅。尽管机械治疗可以有效刮除致炎物质,但器械无法触及复杂结构内的深在区域,难以清除感染因素,因此局部药物治疗仍是牙周治疗中不可或缺的一部分。由于目前常用抗生素类药物存在局限性,如产生耐药性及不良反应等问题,故而,不断优化或找寻更益于牙周临床应用的药物有着深远意义。中药中存在多种活性成分,现已在多种疾病的防治中表现出显著疗效。鹿角多肽(antler polypeptide,AP)作为传统中药鹿角胶中的主要活性成分,被证实具有抗菌、抗炎、免疫调节、抗氧化、降糖、骨改建、抗癌等作用,其中,鹿角多肽在抗炎及骨改建中的作用较为显著。有研究表明鹿角多肽在肺炎、骨关节炎及肠道炎症等炎症疾病中能够通过核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路调节炎症因子表达来抑制炎症反应,在经典骨质疏松模型中,鹿角多肽能够通过降低破骨细胞的分化来抑制骨吸收。目前已知,NF-κB信号通路是调节炎症反应和破骨分化过程中不可或缺的一部分,靶向抑制NF-κB信号通路能够缓解牙周炎在内的多种与骨吸收相关的炎性疾病。鉴于此,我们猜想鹿角多肽可能会经由NF-κB信号通路参与对牙周炎炎症及骨改建的调控作用。经查阅文献,目前尚未见鹿角多肽作用于牙周炎的相关研究。因此,本研究提取鹿角多肽并进行氨基酸组分分析,将获得的鹿角多肽用于小鼠实验性牙周炎模型中,通过Micro-CT、H&E染色,TRAP染色、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法等技术手段,在组织病理及分子生物学层面检测鹿角多肽对小鼠牙周炎牙周组织内破骨细胞分化的影响,探讨鹿角多肽对小鼠牙周炎牙槽骨吸收的影响及作用机制。同时,在体外建立了RANKL与牙周优势致病菌牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Poryromonas gingivlis lipopolysaccharide,Pg-LPS)共同诱导的RAW264.7破骨细胞模型,采用组织学染色及qRTPCR、Western Blot等实验技术,检测鹿角多肽对RAW264.7破骨分化过程中相关基因及蛋白的表达变化,探讨鹿角多肽对炎性环境中破骨细胞分化的作用及其机制。方法:采用酶解法提取鹿角多肽,对其进行氨基酸组分分析,获取性状稳定的鹿角多肽;取48只C5medical coverage7BL/6小鼠,采用丝线结扎selleck激酶抑制剂法诱导小鼠牙周炎模型,随机分为4组:空白对照组(Control)、牙周炎模型对照组(NC)、低剂量鹿角多肽治疗组(250 mg/kg)及高剂量鹿角多肽治疗组(500 mg/kg),采取灌胃方式给药;分别于给药后1 wk和2 wk收集样本进行相应检测分析:1、分离小鼠重要脏器,对其石蜡切片进行H&E染色,评估鹿角多肽的生物安全性;2、Micro-CT扫描、H&E染色及TRAP染色检测鹿角多肽对炎症状态下牙槽骨吸收的影响;3、qRT-PCR法检测牙周组织中炎症因子Tnf-α、Il-1β、Il-10及破骨细胞标志物Trap、Nfatc1、Ctsk的基因表达情况。体外研究采用CCK-8法检测不同工作浓度的鹿角多肽对RAW264.7细胞增殖的影响;以Pg-LPS刺激RAW264.7模拟牙周炎症环境,加入RANKL诱导RAW264.7破骨分化,通过TRAP染色、F-actin染Q-VD-Oph色、qRT-PCR及Western Blot等实验技术,评估鹿角多肽对PgLPS刺激的RAW264.7破骨向分化的影响;随后通过Western Blot法探究在炎症状态下,鹿角多肽影响RAW264.7破骨向分化影响的作用机制。结果:1.成功提取出鹿角多肽,呈乳白色粉末状,氨基酸组分分析表明其氨基酸含量符合药典要求;2.鹿角多肽可降低实验性小鼠牙周炎牙周组织内Tnf-α、Il-1β的mRNA表达,促进抗炎因子Il-10的mRNA表达;3.鹿角多肽可减少实验性小鼠牙周炎牙周组织内破骨细胞的生成,抑制牙槽骨吸收;4.工作浓度为75μg/m L的鹿角多肽对RAW264.7细胞的促增值作用最显著;5.鹿角多肽可显著减少RAW264.7细胞中TRAP阳性的多核细胞个数及所占面积;减小肌动蛋白环尺寸,使肌动蛋白环结构松散;同时抑制RAW264.7中破骨相关因子TRAP、NFATc1、CTSK及MMP-9基因及蛋白的表达;6.鹿角多肽可能经由NF-κB通路在Pg-LPS刺激RAW264.7破骨分化过程中起作用。结论:1.鹿角多肽可以有效缓解实验性小鼠牙周炎炎症反应,抑制实验性小鼠牙周炎牙槽骨吸收;2.鹿角多肽可抑制炎症状态下RAW264.7细胞的破骨向分化,其抑制作用可能是经由对NF-κB信号通路活化的调节实现。