在哺乳动物,极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)组装是在载脂蛋白B(Apolipoprotein B,Apo B)以及微粒体甘油三酯转运蛋白(Microsomal Triglyceride Transfer Protein,MTTP)等分子的协同作用下完成的。其中MTTP是VPS-341半抑制浓度LDL组装和分泌的限速因素。人MTTP基因突变会导致肝内的脂蛋白不能正常装配和转运,肝细胞内合成的脂质分子不能转运出细胞,细胞内脂质堆积,导致血浆中没有Apo B脂蛋白,形成无β-脂蛋白血症。试验证明,改变MTTP活性对VLDL的形成有直接的影响。然而,在鸡上VLDL水平的显著变化与MTTP m RNA表达水平并无关系,表明MTTP不是鸡肝脏VLDL组装和分泌的关键因子。因此,鸡肝脏VLDL组装和分泌机理尚不清楚。课题组在前期的研究中发现,鸡基因组中存在一个类微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP-Like,MTTPL)。该基因与哺乳动物MTTP基因具有相似的核苷酸序列,其对应的蛋白质与哺乳动物MTTP具有保守的基序和功能结构域,而且MTTPL在鸡肝脏中的表达水平与VLDL的浓度呈显著正相关(P<0.05),并以剂量依赖形式受雌激素的调控。课题组前期在细accident and emergency medicine胞水平初步证明了MTTPL的功能,但其表达调控机制以及在个体肝脏脂质代谢中的作用并不清楚。因此本研究分别从转录水平和转录后水平探究雌激素调控其表达的机制,并在个体水平验证MTTPL在鸡肝脏脂质代谢中的作用。本研究首先构建了鸡MTTPL启动子区域序列缺失表达载体,利用生物信息学分析结合双荧光素酶报告检测系统,鉴定了MTTPL启动子的核心调控区域;采用过表达、干扰和双荧光素酶试验鉴定与核心调控区域结合且受雌激素调控的关键转录因子;利用3′RACE技术克隆获得了MTTPL基因3′UTR全长序列,通过生物信息学分析结合双荧光素酶报告系统鉴定出与MTTPL基因3′UTR结合的miRNA;通过过表达试验结合雌激素处理,证明了miRNA靶向调控MTTPL表达的作用机制;然后,构建了MTTPL基因的腺相关病毒干扰载体,利用外源雌激素诱导MTTPL表达,通过功能获得与缺失策略,进一步验证了鸡MTTPL在肝脏脂质代谢中的作用。通过上述3方面研究结果,系统阐明了鸡MTTPL基因在肝脏脂质代谢中的作用及其表达调控机制。主要结果如下:1.研究结果显示,-236bp～+1 bp是MTTPL的启动子核心调控区域,并且筛选到可能与MTTPL启动子区结合的转录因子PPARα与RXRα。过表达PPARα和RXRα能够显著增加MTTPL m RNA表达Metabolism抑制剂量(P<0.05),与之对应地,干扰PPARα和RXRα使MTTPL表达量显著下降(P<0.05)。通过双荧光素酶报告检测系统,验证了过表达PPARα能够增强启动子核心区域荧光素酶的活性,而过表达RXRα对启动子核心区域荧光素酶的活性无影响。雌激素处理试验表明,PPARα与RXRα均受雌激素的正向调控,综上表明,PPARα通过与MTTPL基因启动子核心调控区域的结合直接调控其表达,而RXRα可能通过其他途径间接调节MTTPL的表达。2.首先,通过RACE技术克隆MTTPL 3’UTR的全长序列,其中获得了166 bp的未知序列。随后利用生物信息学预测,筛选获得与MTTPL基因靶向互作的miRNA,miR-7439-3p,并通过双荧光素酶报告系统验证了MTTPL与miR-7439-3p的靶向关系。miR-7439-3p在卢氏绿壳蛋鸡的肝脏、心脏、卵巢、肾脏、胰腺、脾脏、十二指肠、胸肌和腿肌各组织均有表达;在肝脏中,10 w时的表达量显著高于产蛋高峰期30 w(P<0.05)。在LMH细胞系中过表达miR-7439-3p,MTTPL的表达量显著降低(P<0.05),并且miR-7439-3p受到雌激素的负调控,与MTTPL的表达趋势相反,和预期结果一致。过表达miR-7439-3p还使脂肪酸、TC合成相关基因以及脂质转运基因的表达显著降低,而TG合成相关基因显著升高(P<0.05),从而使细胞内TC、VLDL含量降低,TG含量增加。3.在个体水平上,在鸡肝脏中干扰MTTPL,使分泌到血清中的TC、TG和VLDL含量显著降低(P<0.05);通过对肝脏切片的HE/油红染色试验,观察到肝脏脂质的堆积显著增加,并且在一定程度上增加了肝脏的炎性反应,验证了MTTPL在脂质转运过程中的重要作用。综上所述,本试验分别从转录水平、转录后水平探究了MTTPL表达的调控机制,并在个体水平验证了MTTPL在脂质代谢中的作用,进一步阐明鸡脂质代谢调控机制,为家禽生产中提高生产性能奠定理论基础。