RING类E3泛素连接酶(RING E3s)是E3泛素连接酶中成员数量最多的一类,具有抗病毒免疫功能,而疱疹病毒在感染宿主时,通过下调宿主RING E3s的表达或编码RING E3s类似物,抵御宿主免疫反应,从而建立持续性感染。鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)是一种严重危害金鱼、鲫养殖业的高致病性病毒。通过对CyHV-2的基因组进行分析,结果显示ORF144为RING E3s类似物。本论文对CyHV-2 ORF144基因进行了克隆表达,并构建鲫鳃细胞系(Carassius carassius gill cells,CCG),探究ORF144对免疫相关因子表达的影响。1.鲫鳃细胞系(CCG)的构建及对CyHV-2敏感性分析鲫鳃组织采用胰蛋白酶消化法进行原代培养,并通过传代培养成功构建细胞系,目前已传代至90次。对CCG进行生长特性和对CyHV-2敏感性分析,结果显示,CCG最适培养温度为25℃,最适血清浓度为15-20%胎牛血清。细胞核型结果表明,第50代染色体数目是46。CCG转染GFP报告基因效率超过60%,表明CCG可以用于体外基因的研究。感染了CyHV-2的CCG显示出典型的细胞病理学效应(typical cytopathic effects,CPE),通过PCR、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)和透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)证实病毒的增殖。该细胞系为病毒分离和基因功能研究提供了基础的材料。2.CyHV-2 ORF144基因的原核表达及多克隆抗体制备通过PCR扩增得到ORF144Second generation glucose biosensor基因全长,将其与p ET-32a原核表达载体连接构建重组载体p ET-ORF144,转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到大小约46 k Da的以不可溶的包涵体形式存在重组蛋白。将纯化后的重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,ELISA检测显示抗体效价大于1:51200。经Western Blot验证该抗体可特异性识别融合蛋白和感染CyHV-2的细胞中的蛋白质。间接免疫荧光结果显示该蛋白以点状形式定位于细胞质。ORF144定位可为蛋白质的生物学功能提供线索。3.CyHV-2 ORF144对宿主免疫相关因子的调节作用研究构建pc DNA3.1-ORF144、pc DNA3.1-ORF144-ΔRING和pc DNA3.1-STING过表达载体,转染CCG后采用荧光定量PCR方法检测对病毒复制及免疫基因表达的影响。结果显示,过表达ORF144显著促进了主要衣壳蛋白(MCP)和解旋酶ORF99Histone Demethylase抑制剂基因的转录,此外缺失主要RING结构域后显著降低了对病毒基因转录的促进作用。通过定量免疫基因的表达,结果显示ORF144显著抑制STING、IRF3、IRF7、IRF9、MX1、INF-α、IL-1和IL-17的表达,而过表达STING与ORF144的CCG中,ORF144抑制了STING介导的干扰获悉更多素信号分子表达,如IRF3、IRF7、IRF9、MXI,并且缺失RING结构域后这种抑制效果减弱。结果表明,CyHV-2 ORF144依赖于RING结构域抑制免疫相关因子和STING介导的干扰素信号分子表达。本研究成功构建了CCG细胞系,克隆表达了CyHV-2 ORF144基因,获得了相应的多克隆抗体,并证实ORF144可以抑制相关免疫基因的表达来促进病毒复制,为研究CyHV-2免疫逃避机制提供了理论和材料基础。