抗生素等药剂在饲料中的过量添加是影响动物源食品食用安全性的重要因素之一。油脂饼粕中的蛋白质通过微生物发酵可以转化成具有提高动物免疫力的活性多肽,能够部分承担抗生素的作用,因此油脂饼粕发酵受到饲料产业的高度重视。菌种产蛋白酶能力的高低是油脂饼粕蛋白质被转化成为多肽多少的决定性因素,诱变是提高菌种产蛋白酶能力的重要手段。物理诱变具备安全性高、突变稳定性高等优点,且具有多靶点特征的复合物理诱变可以弥补单一诱变的突变局Direct genetic effects限性或抗性饱和现象,突变效果更好。因此,本研究开展了固态发酵方式和产蛋白酶出发菌株的筛选、提高产蛋白酶能力出发菌株的He-Ne激光和紫外联合诱变、基于Ames试验和转录组学的He-Ne激光和紫外两种光源突变机制的探讨、枯草芽孢杆菌中接收红光信号受体蛋白的挖掘等研究工作。主要研究内容与结果如下:(1)豆粕固态发酵方式和产蛋白酶出发菌株的筛选。对比高温固态发酵(枯草芽孢杆菌CICC 22983)和模拟自然变温固态发酵(枯草芽孢杆菌CICC 21927)豆粕两种发酵方式,发现在发酵3天时,霉菌总数显著下降,且大肠菌群<0.3MPN/g,符合卫生指标。模拟自然变温固态发酵组的多肽含量最大为135.63±2.36mg/g。SDS-PAGE、粒径分布和Zeta电位分析发现,模拟自然变温固态发酵在保证发酵质量的前提下,豆粕发酵更彻底。以产蛋白酶和发酵产多肽水平为指标,选取枯草芽孢杆菌CICC 21927作为诱变的出发菌株。(2)He-Ne激光和紫外联合诱变筛选高产蛋白酶突变菌。以微孔板和酶标仪为媒介,建立了产蛋白酶枯草芽孢杆菌CICC 21927的高通量培养、检测和筛选方法。以蛋白酶活为评价指标,优化得到最佳孔板培养条件为:48深孔板、1m L装液量、500 r/min振荡转速、5%接种量,在此条件下,出发菌株的蛋白酶活为58.67 U/m L。采用紫外单独诱变(UV)、激光单独诱变(LA)、先紫外再激光顺序诱变(UL)、先激光再紫外顺序诱变(LU)和紫外激光同步诱变(UV+LA)五种诱变方式对枯草芽孢杆菌CICC 21927进行诱变,发现先激光再紫外顺序诱变(LU)具有最高的正突变率4.30%,而先紫外再激光顺序诱变(UL)降低了枯草芽孢杆菌的致死率。通过初筛、复筛和二次JQ1临床试验诱变筛选到了一株能稳定遗传的突变菌株LU-1-11。16S r DNA序列比较发现,出发菌株和突变菌株均为枯草芽孢杆菌,未发生杂菌污染。模拟自然变温固态发酵豆粕试验发现,突变菌发酵豆粕的多肽含量达到153.1 mg/g,相对于出发菌株提高了12.9Entinostat1%。扫描电镜观察发现,突变菌中大量细胞出现形状不规则,表面皱缩等现象。扩增两株菌的两个中性蛋白酶基因npr E和npr B发现,基因序列未发生变化。基因组重测序结果发现突变菌株产生了5个SNP变异位点和8个结构变异位点,涉及到的基因有deg S、yqb D、yqa S、puc L、srf AA和ync B,其中deg S发生突变可能激活了细胞内蛋白酶的基因,也可能与鞭毛和细胞膜的形成抑制有关,srf AA发生突变可能影响生物膜的形成,使得胞内蛋白酶更容易被释放出来。(3)基于Ames试验的He-Ne激光和紫外辐射导致菌株突变类型研究。以Ames菌株TA97a、TA98、TA100和TA102为模式菌株,以相对回复突变为指标,研究激光和紫外对菌株回复突变以及突变类型的影响。结果表明,激光对TA98和TA100产生回复突变的影响显著高于TA97a和TA102。激光照射30 min后,TA98的回复突变率为对照组的2.16倍。激光照射10 min后,TA100的回复突变率是对照组的3.88倍。紫外照射2 min后,TA102的回复突变率已是对照组的6.68倍。基于1500个激光处理组TA98回复突变体的测序数据发现,激光处理产生了独有的大片段DNA插入和缺失,显著增加了菌株的突变种类。基于760个激光处理组TA100回复突变体的测序数据发现,激光辐射促进了碱基置换中C→A/T的产生。基于192个紫外处理组TA102回复突变体的测序数据发现,紫外辐照更利于菌株发生多向性突变。(4)基于转录组学的He-Ne激光和紫外联合诱变枯草芽孢杆菌机理研究。对五组样本(CK、UV、LA、UL和LU)进行转录组学测序分析,比较CK-vsUV、CK-vs-LA、CK-vs-LU和和CK-vs-UL四个组间差异基因表达量的统计结果发现,与对照组相比,LU组筛选到的差异基因最多。对CK-vs-UV样本关系中的22个差异表达基因进行直接分析发现,紫外通过增强嘧啶类核苷酸合成关键酶类的代谢提高了嘧啶类核苷酸的生物合成。对CK-vs-LA样本关系中的536个差异表达基因进行GO富集和KEGG富集分析发现,激光通过调节跨膜转运蛋白的活性来刺激生长代谢。对UV-vs-LU样本关系中的1891个差异表达基因进行KEGG通路富集分析,针对红光受体光敏色素的结构特征,对双组分系统中显著富集到的89个差异表达基因进行分析后,找到与光敏色素可能相关的组氨酸激酶和其反应调控蛋白的基因。对UV-vs-UL样本关系中的784个差异表达基因进行KEGG通路富集分析发现,与遗传信息过程中的翻译和复制与修复两条代谢途径中的相关基因的表达量发生显示上调,证实激光诱导了紫外损伤的修复功能。选择9个关键基因(lia S、yvf T、yxd K、che A、yko W、uvr C、pcr A、rec A和ruv B)荧光定量PCR检测,发现变化趋势基本上与转录组学数据保持一致。(5)枯草芽孢杆菌中红光受体光敏色素基因分析与功能预测。通过Tbtools软件对枯草芽孢杆菌参考基因组中可能存在的红光受体光敏色素蛋白序列进行比对分析,结合功能结构域预测,推测由基因ytr P编码的二鸟苷酸环化酶可能是枯草芽孢杆菌的类光敏色素。结合转录组学分析发现该基因在UV-vs-LU样本关系中的表达量分别为50.62和102.08,发生显著上调。枯草芽孢杆菌在接受到红光照射后,其ytr P基因编码的蛋白通过GAF结构域接收红光波长信号,进而激活含有GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶和含有EAL结构域的磷酸二酯酶的活性来调控c-di-GMP的浓度,作用于效应蛋白而产生各种生理反应。