背景:骨质疏松症已成为人口老龄化背景下重大的社会卫生问题。当前骨质疏松症的治疗仍以抑制骨吸收为主,但其不能从根本上逆转骨量。目前临床上促进骨合成代谢的药物仅限激素类、骨硬化蛋白抑制剂。因此开发促进骨合成代谢的药物具有重要意义。高通量药物筛选可从现有药物库或天然化合物库中发现化合物的新用途、并研究其新的药理作用机制。相对于传统新药研发,具有研究周期短、简便易行、易于临床转化应用等优势。TAM受体(TYRO3,AXL,MERTK)属于受体酪氨酸激酶家族,在骨组织中广泛表达,已有研究报道MERTK和TYRO3在骨合成代谢中具有关键调控作用,但AXL在骨代谢中的作用机制仍未知。本课题前期研究发现,AXL在卵巢切除术(Ovariectomy,OVX)骨质疏松症小鼠体内低表达,敲除AXL明显加重了 OVX小鼠的骨质疏松症,因此推断AXL也可参与调节骨代谢。目的:(1)观察AXL在OVX对OVX小鼠骨质疏松以及对成骨分化的影响;(2)基于美国食品药品监督管理局批准的药物库(Foodand Drug Administration,FDA)和Pexidartinib天然化合物库,筛选可靶向AXL并促进成骨分化、改善OVX小鼠骨质疏松症的药物;(3)分别在体内外探讨目标药物促进成骨分化和改善骨质疏松症的分子机制。方法:(1)构建OVX骨质疏松C57/BL6小鼠模型,检测AXL在OVX小鼠股骨中的差异表达;提取乳鼠原代成骨细胞,评估成骨分化过程中AXL的动态表达;分别使用AXL配体生长停滞特异性蛋白6(Growth arrest-specific protein 6,GAS6)和其特异性抑制剂R428(Bemcentinib)上调和下调原代成骨细胞中的AXL,观察AXL对成骨分化的作用;构建AXL基因敲除小鼠并诱导OVX骨质疏松(AXL-/–OVX),观察敲除AXL对OVX小鼠骨质疏松的影响;分别提取AXL-/–乳鼠和野生型(WILD)乳鼠原代成骨细胞,观察AXL基因敲除对成骨分化的影响;分别取AXL-/–OVX小鼠和WILD-OVX小鼠股骨,行蛋白质组学测序探究AXL基因敲除PCI-32765核磁后OVX骨质疏松小鼠骨组织中差异表达的蛋白。(2)使用MC3T3-E1前体成骨细胞株,构建AXL荧光报告基因药筛模型,使用高通量药物筛选技术,以AXL荧光强度、CCK-8(Cell Counting Kit-8)为初筛指标,从定制化合物库中筛选能够上调AXL并促进成骨细胞增殖的药物;复筛使用CCK-8测定细胞增殖活性、高内涵细胞成像系统测定AXL和成骨分化标记物Collagen1的荧光强度,并结合文献检索剔除没有研究前景的化合物,选出候选药物;将候选药物与AXL进行分子对接,观察候选药物与AXL的特异性结合能力;设置浓度与时间梯度,观察不同浓度药物对成骨细胞中AXL和ERK5表达的影响,确定目标药物促进成骨分化的最佳干预浓度;选取AXL敲除后下游的差异表达蛋白-细胞外信号调节激酶5(Exautoimmune cystitistracellular signal regulated kinase,ERK5)进行机制研究,并初步观察候选药物对成骨细胞中AXL和ERK5表达、成骨分化的影响以及体内改善OVX小鼠骨质疏松症的疗效。(3)选取复筛结果中可显著改善OVX小鼠骨质疏松症的目标药物进行机制研究;设置浓度梯度,分别观察目标药物对MC3T3-E1前体成骨细胞增殖、凋亡与细胞周期的影响;分别敲减MC3T3-E1前体成骨细胞中的AXL、ERK5,观察ERK5、成骨分化标记物的蛋白表达水平,探究目标药物调节成骨分化的机制;在骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSC)中进一步验证观察目标药物对BMSC成骨分化的影响,观察目标药物能否通过该机制调节BMSC成骨分化,并观察目标药物对BMSC-MC3T3-E1共培养体系中BMSC形态的影响;观察目标药物对RAW264.7巨噬细胞促成骨分化因子分泌以及极化的影响,以及目标药物能否调节RAW264.7-MC3T3-E1共培养体系中的成骨分化;进一步观察目标药物对RAW264.7细胞破骨分化的影响;在体内验证目标药物能否通过调节AXL-ERK5改善OVX小鼠骨质疏松症。结果:(1)与对照组相比,OVX骨质疏松小鼠模型中AXL表达显著下调。AXL在原代成骨细胞分化过程中动态下调,且正向调节原代成骨细胞分化。与WILD-OVX组相比,AXL-/–OVX组骨质疏松症程度明显加重。蛋白质组学分析揭示了 AXL-/–OVX小鼠股骨中差异表达的关键蛋白和信号通路,体外验证了蛋白质组学结果,结合前期研究基础,选取丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路中的 ERK5 进行机制研究。(2)初筛确定了 20种化合物,复筛确定了 4种化合物,分别为Dabrafenib、p-Coumaric Acid、Vildagliptin、Mangiferin。分子对接结果显示,4种化合物与AXL均具有特异性结合位点。体外研究确定了 4种化合物促进MC3T3-E1前体成骨细胞增殖的最佳干预浓度。Mangiferin和Vildagliptin两种化合物均能显著上调MC3T3-E1前体成骨细胞中的AXL/ERK5并促进成骨分化。体内研究结果表明,Mangiferin和Vildagliptin均可改善OVX小鼠骨质疏松,但Vildagliptin上调成骨分化标记物的作用更显著。(3)体外研究结果表明Vildagliptin在50 μM浓度范围内呈浓度依赖性促进MC3T3-E1前体成骨细胞增殖、抑制凋亡,延长S期,并上调MC3T3-E1前体成骨细胞中的AXL/ERK5并促进成骨分化。Vildagliptin可通过调节AXL-ERK5轴促进MC3T3-E1前体成骨细胞分化,促进BMSC成骨分化以及BMSC-MC3T3-E1共培养体系中BMSC形态向成骨细胞转变。Vildagliptin在50 μM浓度范围内呈浓度依赖性促进RAW264.7巨噬细胞分泌骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)和转化生长因子 β1(Transforming growth factor beta,TGF-β1)并向M2型极化,促进RAW264.7-原代成骨细胞共培养体系中原代成骨细胞分化。Vildagliptin在50 μM浓度范围内呈浓度依赖性抑制RAW264.7巨噬细胞破骨分化。体内研究表明,Vildagliptin可通过上调AXL/ERK5,促进成骨分化并改善OVX小鼠骨质疏松。结论:(1)AXL在体外正向调节成骨分化,并在体内发挥骨保护作用。(2)Mangiferin和Vildagliptin均可靶向AXL并促进成骨分化,改善OVX小鼠的骨质疏松症。(3)Vildagliptin可通过AXL-ERK5轴促进MC3T3-E1前体成骨细胞分化、促进BMSC成骨分化、促进RAW264.7细胞分泌促成骨分化因子并向M2型极化、且抑制RAW264.7细胞破骨分化。(4)AXL-ERK5轴是抗骨质疏松药物开发中具有前景的研究靶点。(5)Vildagliptin可作为2型糖尿病伴骨质疏松或骨折高风险人群的首选用药。