研究目的肝癌作为一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤,最常见的类型是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。我国受肝癌影响严重,肝癌已成为威胁人民生命健康的重大隐患,且肝癌的治疗面临着术后易复发、化疗耐药严重等难题,亟需更好的化疗或辅助治疗方案。寻找干预或治疗肝癌的有效手段仍是目前研究的热点。原发性肝癌的形成通常经历慢性炎症—肝纤维化/肝硬化—肝癌的“肝癌三部曲”。肝纤维化主要是由慢性炎症诱发的损伤修复过程中细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的异常积累引起的,目前尚无特异性抗纤维化治疗方法。在长期的肝脏损伤及缺乏有效治疗的条件下,肝纤维化可能会恶化为肝硬化,最终导致肝衰竭或肝癌。肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)是肝纤维化过程中ECM过多产生和异常积累的主要细胞来源。静息状态下,HSC从血液中摄取并储存维生素A(Vitamin A,VA);当肝脏损伤或受到炎症因子等刺激时,HSC被激活并转化为肌成纤维细胞(Myofibroblast,MGNE-140分子式FB),产生胶原蛋白等ECM成分,促进肝纤维化。同时HSC也是肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)的重要组成部分,而超过80%的肿瘤发生在伴direct to consumer genetic testing随着肝纤维化或肝硬化的慢性炎症环境中。TME的改变是肝癌发生的重要标志之一,HSC创造的有利于肿瘤生长及血管生成等的微环境与肝癌的发生发展密切相关。HSC目前已经成为干预肝纤维化的潜力靶点,因此我们设想可能通过抑制HSC的激活或杀伤HSC,来影响肝纤维化进程,调节TME,最终抑制HCC的发生及发展。国内外已有利用HSC倾向于从血液中摄取和储存VA的特性、制备靶向HSC的VA修饰的纳米药物的报道,但与原发性肝癌相关的研究较少。阿霉素(Doxorubicin,DOX)通过抑制DNA和RNA的合成广泛杀伤肿瘤细胞,自发的红色荧光可用于体内外示踪,曾是肝癌传统化疗药物,但具有较强的心脏毒性,现在常用于肝癌的临床化疗栓塞治疗。纳米脂质体是临床接受度较高的一种纳米载体,生物相容性高、药代动力学参数良好,能改善化疗药物在体内的分布情况、减少全身毒副作用,提高递药效率,且表面易于修饰,而在研究中被广泛应用。综上,本课题以脂质体作为DOX的纳米载体,并且在脂质体的表面修饰VA靶向HSC递送DOX,观察其对HSC摄取的影响及作用;随后在大鼠模型中,观察制备的脂质体在肝纤维化和肝癌发生、发展过程中的作用,并研究其在细胞与分子层面的影响,为机制探讨提供实验现象及为肝癌发生及发展的干预或治疗提供新的思路。研究方法及结果第一章维生素A修饰的阿霉素脂质体的制备及表征鉴定我们首先通过薄膜水化法和硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体(Dox-Lipo)、维生素A修饰的阿霉素脂质体(VA-Dox-Lipo)、空白脂质体等,并对脂质体进行粒径、电位、体外稳定性、透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)图像等表征鉴定,采用液相色谱法检测脂质体的DOX浓度与包封率等,并通过免疫荧光染色等实验评价体内外大鼠HSC对脂质体的摄取情况,通过细胞计数试剂-8(Cell counting kit-8,CCK-8)法比较脂质体对HSC的毒性作用。实验结果显示,VA-Dox-Lipo在体外及体内均有效地增强了HSC对它的摄取;在一定浓度下,比起游离DOX和Dox-Lipo,VA-Dox-Lipo更有效地降低了HSC的细胞活力并抑制HSC增殖。此部分结果表明制备的脂质体符合课题设想,可用于后续的实验研究。第二章维生素A修饰的阿霉素脂质体对肝癌发生的作用研究在此章节中,我们建立了二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)诱导的大鼠肝纤维化至原发性HCC发生的模型,并在诱癌第6-9周即HCC发生阶段,对大鼠进行了Free DOX、Dox-Lipo及VA-Dox-Lipo的尾静脉注射给药。在DEN诱癌第15周对大鼠进行收样后,通过天狼猩红染色、免疫组织化学染色、H&E染色、q RT-PCR、Western Blotting、CCK-8等一系列实验观察了处理组对大鼠肝纤维化程度及肝癌发生的影响,如胶原染色、激活的HSC定位、纤维化有关分子的RNA水平表达、肿瘤数量与最大体积、肿瘤标志物、血清肝功能检测、肝脏病理结构等,并在体内外观察了各种干预对肝前体细胞(Hepatic progenitor cell,HPC)激活与增殖、以及对体内大鼠肝脏干性的作用。实验结果表明,VA-Dox-Lipo可能通过杀伤HSC或抑制其激活,更显著地减轻了大鼠肝脏纤维化程度,改善了HCC发生前的肝脏微环境,进而更好地抑制了HPC的增殖与HCC的发生。第三章维生素A修饰的阿霉素脂质体对肝癌发展的作用研究第三章中我们同样使用了DEN诱导的大鼠HCC的模型,在HCC发展阶段即诱癌第11-14周,对大鼠进行Free DOX、Dox-Lipo及VA-Dox-Lipo的处理,并同样在第15周收样后,通过组织切片染色、q RT-PCR、Western Blotting等一系列实验,观察不同处理组中大鼠肝纤维化程度及肝癌发展的情况。我们发现VA-Dox-Lipo仍可以较好地减少激活的HSC的数量与肝脏的胶原沉积;优于游离DOX,Dox-Lipo与VA-Dox-Lipo组均可有效降低肝纤维化有关分子的m RNA水平,改善肝功能、减轻心脏毒性。尤其是VA-Dox-Lipo组显著地减少了肿瘤数量与最大体积,在体内抑制肝癌的增殖发展、降低肝脏肿瘤细胞的干性。体外结果也显示,VA-Dox-Lipo更有效地抑制HSC上清刺激的肝癌细胞的增殖。上述结果表明,VA-Dox-Lipo可能通过下调HSC的激活而影响纤维化有关的TME,抑制了HCC的增殖、发展。结论综合分析以上章节的实验结果,本课题可得出以下结论:1.成功制备了增强HSC体内外摄取能力的约200 nm粒径的VA-Dox-Lipo,粒度均匀、稳定性良好,DOX浓度与包封率较高,符合脂质体形态学特征,并且具有较强的HSC细胞毒性。2.VA-Dox-Lipo在HCC的发生与发展阶段的干预均减少了肿瘤的数量、最大体积和肝癌标志物阳性细胞的数量,改善了DEN诱导的HCC大鼠的肝功能与肝脏病理结构,抑制HCC的发生与发展;同时均有效减少了激活的HSC数量,减轻DEN诱导的大鼠肝纤维化程度,调节了癌前微环境与TME。3.VA-Dox-Lipo在HCC形成前、后阶段的干预分别通过减selleck化学弱HPC与肿瘤细胞的激活、增殖与干性,限制了HCC的发生与发展。