“脑卒中”(cerebral stroke)又称“中风”,是由于脑部血管因血管阻塞或突然破裂导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病,1990年至2019年间全球范围内突发性中风发生率增加70.0%,中风死亡人数增加43.0%,疾病负担大幅增加[1,2]。我国脑卒中现患人数高居世界首位,已成为导致我国成年居民死亡和残疾的首位病因,防治工作任重道远。前期课题组为解决脑型疟一线治疗药物青蒿琥酯杀死人体内疟原虫后死亡虫体仍滞留于脑血管致远期神经损伤的临床难题,针对脑型疟的病理特点“机械阻塞”,筛选4种活血化瘀类中药注射剂与青蒿琥酯联用,发现青蒿琥酯与川芎嗪联用时对脑型疟引起的缺血性损伤保护作用最为显著,并对两者单用与联用的药效进行了比较,还进行了联用配比效价实验、经鼻给药与注射给药药效比较研究、药代动力学研究,证实了两者对于脑组织缺血性损伤协同增效的保护作用。前期研究证实联用经鼻给药可显著提高实验性脑型疟小鼠存活率,减轻神经损伤症状,通过保护血脑屏障结构、增加紧密连接蛋白表达等作用减轻血脑屏障损伤,根据亚硝基化点点突变等研究发现其作用与NO的合成代谢有关。青蒿琥酯-川芎嗪联用治疗脑型疟已获国内[3]、国际专利[4]授权。由于缺血性脑卒中由血栓或斑块阻塞血管造成,同样具有由血管堵塞引起一系列的血脑屏障损伤、神经后遗症等现象,根据异病同治理论,即不同疾病在发病过程中某个阶段如表现出相同的病机,治疗时可选用同样的治则和方药。我们提出了本课题的假说,即青蒿琥酯-川芎嗪鼻腔给药对脑卒中缺血性损伤也有保护作用。本研究旨在通过数据分析预测和实验验证,探索青蒿琥酯-川芎嗪联用对缺血性卒中是否具有保护效应,及其可能的作用机制,为青蒿琥酯-川芎嗪联用进一步开发应用提供实验支撑,并为青蒿素及其衍生物应用价值链拓展提供依据。1.研究方法1.1青蒿琥酯-川芎嗪联用对缺血性脑卒中影响的网络药理学预测分析基于网络药理学对青蒿琥酯-川芎嗪联用治疗缺血性脑卒中作用的机制进行初步预测。检索并汇总缺血性脑卒中相关的人类疾病公开数据库和高识别度生物标记物的临床报道并进行聚类分析,并分别基于NCBI的GEO数据库和NCBI、Web of science和中国知网等数据库检索MCAO模型致动物缺血性脑卒中的高通量转录组学和高通量蛋白质组学测序相关研究,以log2 FC>1或<-1为标准筛选差异基因和差异蛋白,并进行GO、KEGG分析,获得关键因子和重要生物过程与通路。取上述全部靶点进行合并和去除重复项,获得缺血性脑卒中疾病靶点。利用 TCMSP、Swisstergetprediction 和 PharmMapper 对青蒿琥酯、川芎嗪相关靶标进行筛选和预测。将两单体与疾病靶点进行矫正和分析,对重要靶点进行PPI分析,关系较为紧密的定义为关键靶点,对关键靶点进行GO、KEGG分析,构建青蒿琥酯-川芎嗪联用关键靶点、关键通路的网络关系。1.2青蒿琥酯-川芎嗪联用改善大鼠MCAO模型脑缺血性损伤的作用评价1.2.1分组与给药SD大鼠适应性喂养1周后按体重随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、青蒿琥酯-川芎嗪联用低剂量组、青蒿琥酯-川芎嗪联用高剂量组、阳性药组。Sham组动物进行假手术处理,其余各组使用MCAO模型致动物缺血性脑卒中。术后24 h、48 h、72 h行为学评分后分别对动物滴鼻给药(Sham、Model组滴鼻生理盐水,青蒿琥酯-川芎嗪联用低、高剂量组分别滴鼻相应浓度的青蒿琥酯和川芎嗪注射液,阳性药组滴鼻金纳多注射液),给药量为50 μL。1.2.2青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠整体状态、存活率的影响分别于术后24 h、48 h、72 h记录动物体重,观察动物毛发、精神状态和动作灵活性等,记录各组存活率。1.2.3青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠神经功能损伤评分的影响分别于术后24 h、48 h、72 h对MCAO大鼠的屈曲、张力、运动轨迹进行神经功能评分并记录,计算各组72 h与24 h评分差值,计算各个时间点行为学总分。1.2.4青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠脑梗死和组织病理损伤的影响MCAO术后72 h麻醉动物并用预冷的生理盐水从心尖灌流,取脑组织。每组随机选取3只动物的脑组织置于模具中,冠状切2 mm片,使用2%TTC染色,4%多聚甲醛中固定24 h后拍照,并借助Image J量化梗死面积,计算脑组织梗死率。另每组随机选取3只动物的脑组织于4%多聚甲醛浸泡固定24 h,酒精脱水并用石蜡包埋,连续冠状切片,选取囟门前后各3mm区域的切片(厚度约5μm)进行后续实验。将石蜡切片进行HE染色,光镜下观察脑组织皮层、海马体CA 1区、CA3区、DG区的病理变化。1.2.5青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠血脑屏障损伤的影响每组随机选择3只动物术后70 h后尾静脉注射2%伊文思蓝,术后72 h麻醉动物并用预冷的生理盐水灌流,取脑组织,分离缺血侧半球,浸泡于3 mL甲酰胺中于37℃孵育24h后检测620 nm吸光度以评价BBB完整性。免疫组化法检测脑组织紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin,选取皮层同一位置,在显微镜下观察并计数阳性细胞数。1.2.6青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠脑组织细胞凋亡的影响石蜡切片TUNEL染色,选取皮层同一位置,在显微镜下观察并计数阳性细胞数。使用Western Blot检测梗死侧皮层组织中调亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。1.3基于预测关键靶点相关因子的青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠保护作用机制探索ELISA法检测动物血清和梗死侧皮层组织中TIMP-1、MMP-9的表达水平,计算两者比值。使用RT-qPCR法和Western Blot法检测动物梗死侧脑组织中 TIMP-1、MMP-9、HIF-1α、VEGFA 的 mRNA 和蛋白表达水平,计算 MMP-9/TIMP-1比值。免疫组化法对TIMP-1、MMP-9进行定位和定量。1.4青蒿琥酯-川芎嗪联用对SK-N-BE细胞氧糖剥夺损伤模型的保护作用和机制研究1.4.1不同浓度青蒿琥酯、川芎嗪对细胞存活率的影响借助CCK-8法检测10-1000μM青蒿琥酯、川芎嗪及两者合用处理细胞12 h后细胞的存活率,以确保后续实验所用的药物浓度在安全范围内。通过观察细胞形态和CCK-8检测结果确定OGD模型条件,并基于稳定的OGD模型摸索青蒿琥酯-川芎嗪联用的适宜浓度。1.4.2青蒿琥酯-川芎嗪联用对细胞TIMP-1、MMP-9的mRNA表达的的影响OGD4h后收集细胞总RNA,对TIMP-1、MMP-9的mRNA表达进行定量,并计算MMP-9/TIMP-1比值。1.5小干扰RNA(siRNA)转染1.5.1确认转染试剂安全范围24孔板每孔5 000-7 500个细胞,培养至密度达到60%-80%后,每孔分别加 1、2、3、4、5 μL 转染试剂 Lipofectamine 2000 处理 24 h 后,借助 CCK8 检测细胞存活率。1.5.2细胞转染24孔板培养细胞至密度达到60%-80%后换液,每孔换为400 μL完全培养基。细胞分为Control组、阴性对照组、阳性对照组、TIMP干扰1组、TIMP干扰2组、TIMP干扰3组。Control组全程置于培养箱中培养,阴性对照组加入 Negative control RNA oligo,阳性对照组加入 GAPDH Positive control RNA oligo,TIMP干扰各组分别加入相应TIMP RNAi oligo。在离心管中加入500 μL无血清培养基,加入2μL Lipofectamine 2000,轻轻混匀,室温静置5 min。在另一离心管中加入500 μL无血清培养基,加入40 p mol相应的RNA oligo,轻轻混匀,室温静置5 min。将含Lipofectamine 2000的混合液滴至含RNA oligo的混合液中,轻轻混匀,室温静置15 min,分别加入24孔板培养的各组细胞中,每孔终体系为500μL,轻轻晃动培养板后放入培养箱中培养6 h,更换为完全培养基,继续培养24 h,提取mRNA进行Rt-qPCR检测。1.5.3基于OGD模型观察siRNA干扰后青蒿琥酯-川芎嗪的保护作用96孔板细胞分为Control组、Model组、TIMP干扰组、青蒿琥酯-川芎嗪低剂量组(75 μM)、青蒿琥酯-川芎嗪高剂量组(150 μM),细胞使用2.11.2中的方法进行转染6 h后,将上清换为含药培养基,继续培养24 h,OGD 4 h后借助CCK-8检测细胞存活率。24孔板细胞操作同上,OGD4h后收集细胞RNA。2.研究结果2.1Drug Discovery and Development基于大数据分析预测青蒿琥酯-川芎嗪联用对缺血性脑卒中的作用及关键因子2.1.1 基于GEO数据库脑卒中“临床高度识别的生物标记物”分析对临床生物标志物、转录组学、蛋白组学数据进行分析,获取缺血性脑卒中相关的关键靶点和生物学过程。对临床生物标志物进行聚类,发现缺血性脑卒中主要涉及的生物过程包括NOS等缺氧的反应,IL-6、CCL-2等炎症反应,VEGFA、MMP等血管生成,TIMP-1、MMP-9、MMP-2等细胞外基质分解。分析转录组数据共获得35个关键差异基因,包括Itgb6等5个上调基因,及Timp1、Ccl2、S100a8等30个下调基因,主要参与IL-17信号通路、TNF信号通路、ECM受体相互作用、凋亡等通路。分析蛋白组学数据发现关键差异蛋白主要的生物学过程包括神经递质分泌的调节、树突的发育、细胞成熟的调节、突触前内吞和突触后神经递质受体的内化等。2.1.2基于网络药理学青蒿琥酯-川芎嗪联用干预靶点预测基于网络药理学对青蒿琥酯-川芎嗪联用对抗缺血性脑卒中损伤的机制进行初步预测。在数据库和文献中共获得缺血性脑卒中相关靶点1826个,川芎嗪(TMP)靶点31个,青蒿琥酯(AS)靶点105个。分析后得到候选靶点78个,筛选后有VEGFA、MMP9、MMP-2等核心靶点25个,主要与细胞凋亡、细胞增殖和血管平滑肌细胞增殖有关,聚焦于VEGF、雌激素、TNF、PI3K-Akt等信号通路。2.2青蒿琥酯-川芎嗪联用改善大鼠MCAO模型脑缺血损伤的药效评价2.2.1青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠整体状态、存活率的影响基于稳定的MCAO模型对青蒿琥酯-川芎嗪联用药效进行了初步评价。实验终点为MCAO手术后72 h,Sham组动物存活率100%,Model组动物存活率为60%,青蒿琥酯-川芎嗪联用低剂量组存活率为69%,青蒿琥酯-川芎嗪联用高剂量组存活率为73%,阳性药组存活率为71%。2.2.2青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠神经功能评分的影响行为学评分显示,在实验终点(MCAO手术后72 h)时Model组大鼠出现明显的神经损伤,行为学评分总分显著高于Sham组(P<0.001),提示脑缺血后行为异常,神经损伤;与Model组相比各给药组总评分均显著降低(P<0.01),提示各药物均显著减轻MCAO手术后大鼠神经损伤;通过72 h和24 h行为学评分的差值可更直观地观察到青蒿琥酯-川芎嗪联用对缺血性脑卒中大鼠神经行为学的改善作用;各给药组动物在24 h、48 h、72 h前肢屈曲和肌张力损伤评分均显著低于Model组评分。2.2.3青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠脑组织损伤的影响TTC染色与梗死面积量化结果显示,Model组梗死率为36.65±2.20%,与Sham组相比显著增大(P<0.001);青蒿琥酯-川芎嗪联用低剂量组梗死率为35.42±1.31%,与Model组相比显著减小(P<0.05);青蒿琥酯-川芎嗪联用高剂量梗死率为29.63±2.49%,与Model组相比显著减小(P<0.01);阳性药组梗死率为27.78±2.17%,与Model组相比显著缩小(P<0.05,P<0.01),表示各药物治疗后缓解了缺血损伤。HE染色结果显示,Model组大鼠皮层结构损伤严重,细胞数量减少,给药组表现出不同程度的改善。3.2.4青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠BBB损伤的影响伊文思蓝结果显示,与Sham组相比,Model组吸光度值显著升高(P<0.01),提示MCAO手术后动物血脑屏障遭到破坏。与Model组相比,各给药组吸光度均显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01),提示各药物治疗后血脑屏障的损伤较轻。免疫组化结果显示,Sham组ZO-1、occludin棕色阳性区域围绕蓝色核周围分布,Model组细胞间隙增大,阳性区域减少。青蒿琥酯-川芎嗪低、高剂量组阳性区域稍有增加,细胞间隙减小。2.2.5青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠脑组织凋亡情况的影响借助TUNEL染色观察皮层、海马CA1区、CA3区、DG区神经细胞形态、数量和凋亡情况。Sham组各区少见坏死或凋亡的神经细胞。Model组梗死半球各区观察到大量凋亡的神经元细胞(棕色),皮层部位神经元凋亡现象最为明显,各给药组各区凋亡现象较少出现,多见表现为核固缩的坏死现象(深蓝色),本部分对神经细胞数量进行量化和统计。与Sham组相比,Model组皮层、海马CA1区、海马CA 3区、海马DG区细胞数量均显著减少(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001),细胞坏死、凋亡现象明显。与Model组相比,各给药组可见细胞数不同程度显著增多。Western Blot结果显示,与Sham组相比,Model组动物梗死侧皮层中Bax蛋白的表达量显著增加(P<0.05);与Model组相比,各给药组Bax蛋白的表达均显著减少(P<0.05,P<0.005,P<0.05)。与Sham组相比,Model组动物皮层中Bcl-2的表达有下降趋势,各给药组的表达量有回调趋势。与Sham组相比,Model组Bax/Bcl-2比值显著升高(P<0.01),提示严重的细胞凋亡;与Model组相比,各给药组比值均回调(P<0.01,P<0.005,P<0.05)。2.3基于预测关键靶点相关因子的青蒿琥酯-川芎嗪联用对MCAO大鼠保护作用机制探索基于较好的药效和大数据分析预测,对青蒿琥酯-川芎嗪联用治疗实验型脑缺血机制进行初步探索。动物血清ELISA结果显示,与Sham组相比,Model组TIMP-1表达水平显著降低(P<0.01),MMP-9表达水平显著升高(P<0.05),MMP-9/TIMP-1比例显著升高(P<0.01)。与Model组相比,各给药组TIMP-1表达水平显著升高且趋于正常(P<0.05,P<0.01,P<0.05),MMP-9表达水平显著降低(P<0.001,P<0.001,P<0.001),MMP-9/TIMP-1 比例显著降低(P<0.005,P<0.005,P<0.005)。动物梗死侧皮层组织ELISA结果显示,与Sham组相比,Model组TIMP-1表达水平显著降低(P<0.05),MMP-9表达水平显著升高(P<0.005),MMP-9/TIMP-1比例显著升高(P<0.005)。与Model组相比,各给药TIMP-1表达水平显著升高且趋于正常,但无显著差异;高剂量组、阳性药组MMP-9表达水平显著降低(P<0.01,P<0.01),低剂量组有下降趋势但无显著差异;MMP-9/TIMP-1 比例均显著降低(P<0.05,P<0.005,P<0.01)。免疫组化结果可见Sham组MMP-9几乎无棕色阳性区域,Model组细胞间隙增大,阳性区增多且分布在细胞间隙中。与Model组相比,青蒿琥酯-川芎嗪低、高剂量及阳性药组阳性区域稍有减少,细胞间隙减小。Sham组TIMP-1棕色阳性区域围绕在蓝色细胞和周围,Model组细胞间隙增大Bucladesine配制,几乎无阳性区域。与Model组相比,青蒿琥酯-川芎嗪低、高剂量及阳性药组阳性区域增加,细胞间隙减小。动物梗死侧皮层RT-qPCR结果与Western Blot结果趋势相同。结果显示,与Sham组相比,Model组HIF-1α的表达量显著增加;与Model组相比,各给药组HIF-1α表达量均显著降低。与Sham组相比,Model组VEGFA表达量显著减少;与Model组相比,各给药组VEGFA表达量均显著升高。与Sham组相比,Model组TIMP-1表达量显著减少,MMP-9表达量显著增多,两者比值显著升高;与Model组相比,各给药组TIMP-1表达量均显著升高,MMP-9表达量显著降低,两者比值显著降低,MMP-9/TIMP-1的比值趋于正常。2.4青蒿琥酯-川芎嗪联用对SK-N-BE细胞OGD模型MMP-9、TIMP-1mRNA表达的影响为了确定在实验中药物本身是否对细胞造成损伤,确定合理的给药浓度范围,借助CCK-8,检测药物处理12 h后细胞的存活率。结果显示10-1000 μM浓度范围内的注射用青蒿琥酯和10-1000 μM浓度范围内的川芎嗪注射液作用12 h对细胞活力无明显影响,可用于后续实验。建立OGD模型,观察细胞形态可见Control组细胞分布均匀,形态饱满。OGD 4 h后细胞数量显著减少,形态皱缩,与Control组相比,存活率显著降低,为48.91%;OGD 6 h后细胞显著减少,形状异常,与Control组相比,存活率显著降低,为20.59%。选择OGD4h进行后续实验。摸索青蒿琥酯-川芎嗪联用浓度,可见Control组细胞分布均匀,形态饱满。Model组OGD 4 h后细胞形状皱缩,存活率显著降低(P<0.001);与Model组相比,青蒿琥酯-川芎嗪联用50、75、150 μM剂量组细胞存活率显著升高(P<0.05,P<0.001,P<0.001),300 μM剂量组有增加趋势,但无显著差异,各给药组细胞形态不同程度趋于正常。基于SK-N-BE细胞建立OGD模型后,与Control组相比,Model组TIMP-1 mRNA表达量显著减少(P<0.001),MMP-9 mRNA表达量显著增加(P<0.001),MMP-9/TIMP-1 比值显著变大(P<0.001)。与 Model 组相比,AT-50组TIMP-1 mRNA表达量显著增加,MMP-9 mRNA表达量显著减少,但无显著差异,MMP-9/TIMP-1比值显著减小(P<0.05);AT-75组TIMP-1 mRNA表达量显著增加(P<0.01),MMP-9 mRNA表达量显著减少(P<0.05),MMP-9/TIMP-1 比值显著减小(P<0.01);AT-100 组 TIMP-1 mRNA表达量显著增加(P<0.005),MMP-9 mRNA表达量显著减少(P<0.005),MMP-9/TIMP-1比值显著减小(P<0.001)。2.5 TIMP干扰对青蒿琥酯-川芎嗪联用OGD损伤保护作用的影响2.5.1确认转染试剂安全范围与Control组相比,使用1 μL Lipofectamine 2000时细胞存活率无显著降低,2-5μL的Lipofectamine 2000均会引起细胞存活率不同程度的显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.001)。2.5.2 siRNA转染效率检测与Control组相比阴性对照组TIMP表达水平无显著变化,阳性对照组GAPDH mRNA表达水平显著降低,TIMP oligo 1、2、3处理后细胞TIMP-1 mRNA表达水平均不同程度显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05),其中oligo 1处理后敲低效果最明显,后续使用oligo 1继续实验。2.5.3基于OGD模型观察干扰TIMP-1后青蒿琥酯-川芎嗪对细胞存活率的影响与Control组相比,Model组细胞在OGD后细胞存活率显著下降(P<0.001)。与Model组相比,TIMP基因干扰细胞OGD后细胞存活率显著下降(P<0.001)。与TIMP干扰组相比,青蒿琥酯-川芎嗪低剂量、高剂量组细胞存活率均显著升高(P<0.001,P<0.001)。2.5.4基于OGD模型观察干扰TIMP-1后青蒿琥酯-川芎嗪对TIMP-1、MMP-9 mRNA表达水平的影响与Control组相比,Model组TIMP-1 mRNA表达水平显著降低(P<0.001),MMP-9 mRNA表达水平显著升高(P<0.001),MMP-9/TIMP-1比值显著升高(P<0.05)。与Model组相比,TIMP干扰组TIMP-1 mRNA表达水平显著降低(P<0.005),MMP-9 mRNA表达水平显著升高(P<0.005),MMP-9/TMRTX1133生产商IMP-1比值显著升高(P<0.001)。与TIMP干扰组相比,青蒿琥酯-川芎嗪低剂量、高剂量组TIMP-1 mRNA表达水平均不同程度显著升高(P<0.001,P<0.001),MMP-9mRNA表达水平显著均不同程度显著降低(P<0.001,P<0.001),MMP-9/TIMP-1 比值均不同程度显著降低(P<0.001,P<0.001)。3.结论青蒿琥酯-川芎嗪联用鼻腔给药,可改善MCAO模型大鼠整体状态和存活率,降低梗死率,减轻脑组织病理损BBB损伤、及皮层神经细胞凋亡,减轻动物神经功能损伤,对缺血性脑卒中具有保护作用。调节MMP-9和TIMP-1的表达及两者的比例,可能是青蒿琥酯-川芎嗪联用保护血脑屏障完整性相关关蛋白,减轻脑卒中缺血性损伤的核心机制之一。