雷帕链霉菌又称为吸水链霉菌,可发酵生成雷帕霉素、洋橄榄叶素和放线菌酸等具有多种生物活性的次级代谢产物,对农业、工业及医药研究等领域有着较为重要的作用。双组分系统普遍的存在于原核生物中,能够参与菌株的生长发育、点击此处形态分化、初级代谢、次级代谢、菌株毒性、渗透压等生理活动进程。碱基编辑器是基于CRISPR/Cas系统,但不依赖于双链断裂的基因编辑工具,适用于同源重组能力较弱的菌株基因组改造。目前,雷帕链霉菌发酵产生的雷帕霉素和洋橄榄叶素产量较低,生产成本高,且雷帕链霉菌的同源重组能力较弱。因此,本研究通过探究雷帕链霉菌中双组分系统调控抗生素生物合成分子机制以及开发碱基编辑器,有利于解析雷帕链霉菌的代谢调控网络、为链霉菌的遗传改造提供指导依据。(1)对雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinious)NRRL 5491中对M271＿22640/M271＿22645(CseB-C_(SR))、M271＿28325/M271＿28330和M271＿14685/M271＿14690这3对双组分系统的编码基因进行了基因敲除;与出发菌株NRRL 5491相比,敲除M271＿28325/M271＿28330、M271＿14685/M271＿14690使雷帕霉素产量分别提高了54.71%、55.36%,而敲除cseB-C_(SR)使雷帕霉素产量降低了91.18%。有趣的是,ΔcseB-C_(SR)中洋橄榄叶素的产量提高了52.45%。采用二苯胺比色法对菌株的生长情况进行检测,发现敲除cseB-C_(SR)对菌株的生长无明显的影响。对ΔcseB-C_(SR)进行基因回补实验,雷帕霉素和洋橄榄叶素的产量均可以得到恢复。(2)为了进一步探究雷帕链霉菌中CseB-C_(SR)调控雷帕霉素和洋橄榄叶素生物合成的分子调控机制,本研究通过半定量RT-PCR技术对出发菌株NRRL 5491和突变株ΔcseB-C_(SR)的基因转录水平进行了分析。结果表明,sigE_(SR)、cse A_(SR)、rapA购买SB203580、rapP、rapG、rapH和elaI等基因的转录下调,rapS/R、rapY、elaA、elaB、ela3和M271＿22625等基因的转录上调,rapT和M271＿22615的转录无明显变化。在ΔcseB-C_(SR)菌株中过表达sigE_(SR)可以使雷帕霉素和洋橄榄叶素的产量得到恢复。最后,凝胶阻滞实验(EMSA)实验证明应答调控蛋白CseB_(SR)能与sigE_(SR)启动子区域直接结合,表明CseB_(SR)通过调控sigE_(SR)的转录进而参与雷帕霉素和洋橄榄叶素生物合成的调控。(3)由于雷帕链霉菌的同源重组能力较低,为方便对其进行基因改造,本研究在雷帕链霉菌中开发了SPACE碱基编辑器,可以同时实现胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)的转换。通过在胞嘧啶碱基编辑器dCas9-CDA-UL_(str)中引入TadA-TadA*,获得碱基编辑质粒pKC-ABE-CBE。然后在rapS、rapS2、paediatric emergency medrapH、rapX和rapY 5个位点进行了测试,均可以实现C到T和A到G的碱基编辑。SPACE碱基编辑器中A到G的编辑窗口为-14到-16 bp,C到T的编辑窗口为-16到-20bp。综上所述,本研究鉴定了双组分系统CseB-C_(SR)在雷帕链霉菌中正调控雷帕霉素、负调控洋橄榄叶素生物合成的功能;通过转录分析结合EMSA实验结果鉴定出sigE_(SR)是CseB_(SR)的靶基因;此外,还首次在链霉菌中开发了能够同时实现胞嘧啶到胸腺嘧啶、腺嘌呤到鸟嘌呤转换的碱基编辑器;有利于推动雷帕链霉菌功能基因筛选和代谢工程改造提高雷帕霉素的发酵水平。