目的:作为阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)的主要病理学特征之一,β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)周围存在活化的小胶质细胞,根据其活化特征及功能状态,分为介导神经毒性作用的M1表型和介导神经保护作用的M2表型,通过释放不同效应因子,影响AD神经免疫微环境,介导神经元存活和功能变化。已有研究表明,钙稳态与小胶质细胞的激活密切相关;而线粒体相关内质网膜(Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,MAM)作为联系内质网和线粒体的枢纽,在维持线粒体钙稳态中发挥着核心作用。然而关于MAM介导的钙稳态能否调控AD过程中小胶质细胞的活化及表型转化,尚待研究。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)可通过减少AD神经炎症逆转认知缺陷,然而其能否调控MAM介导的线粒体钙稳态,影响小胶质细胞表型转化尚不明确。因此,本文从MAM介导的钙稳态调控小胶质细胞表型转化的角度出发,探讨MSC的抗AD作用及可能机制。研究方法:动物给药与分组:选取12只7月龄APP/PS1转基因小鼠,将其Dorsomorphin化学结构随机分为APP/PS1组和APP/PS1+MSC组,同月龄亲本C57BL/6J小鼠6只作为对照(WT组)。APP/PS1+MSC组按2×10~6个细胞/只进行尾静脉注射MSC,WT组和APP/PS1组同步注射等体积PBS,每两周注射一次,持续12周。细胞造模与分组:应用LPS+Aβ诱导的BV2细胞建立MG活化模型,LPS+Aβ组,LPS+Aβ+MSC组,同步设立control组,在此基础上,使用σ1R抑制剂BD1047,建立LPS+Aβ+MSC+BD1047组。(1)通过Western Blot实验检测M1/M2相关炎性因子iNOS、IL1β、Arg1和TGFβ表达;通过免疫荧光法考察线粒体钙水平。(2)应用上述各组细胞培养液对SH-Support mediumSY5Y细胞进行条件培养,CCK8法检测SH-SY5Y细胞的存活率;Western Blot检测突触可塑性蛋白PSD95和GAP43的表达。(3)应用线粒体钙抑制剂Ru360处理LPS+Aβ诱导的BV2细胞,通过免疫荧光染色法考察线粒体钙水平,Western Blot检测M1/M2相关炎性因子iNOS、IL1β、Arg1和TGFβ表达;应用上述各组细胞的培养基对SH-SY5Y细胞进行条件培养,通过CCK8法检测细胞存活率,Western Blot检测突触可塑性蛋白PSD95和GAP43的表达。(4)通过免疫荧光染色考察mtROS表达;Western Blot检测线粒体动力学蛋白Drp1和Mfn2表达;通过流式细胞术检测各组细胞线粒体膜电位。(5)通过透射电镜观察小胶质细胞MAM的长度和覆盖面积;Western Blot检测MAM钙转运蛋白IP3R、GRP75、VDAC1表达。(6)通过Western Blot检测σ1R表达。结果:(1)MSC促进AD小胶质细胞M1/M2表型转化可能与其改善线粒体钙超载有关:MSC可以使APP/PS1小鼠皮质以及LPS+Aβ诱导的BV2细胞中IL1β、iNOS的表达下降,Arg1、TGFβ的表达上升(PBMS-907351使用方法<0.05);使线粒体钙含量下降。(2)MSC能够促进BV2细胞M1/M2表型转化发挥神经保护作用:MSC可以使LPS+Aβ诱导的BV2细胞条件培养基条件培养的SH-SY5Y细胞的存活率和突触可塑性蛋白GAP43、PSD95的表达上升(P<0.05)。(3)LPS+Aβ诱导的线粒体钙超载是调控BV2细胞M1/M2表型转化,改善神经元存活和突触可塑性的关键环节:线粒体钙抑制剂Ru360可以降低LPS+Aβ诱导的BV2细胞线粒体钙含量,使IL1β、iNOS表达下降,Arg1、TGFβ表达上升;提高条件培养的SH-SY5Y细胞存活率和GAP43、PSD95的表达(P<0.05)。(4)MSC能够改善小胶质细胞线粒体稳态失衡:MSC可以使APP/PS1小鼠皮质小胶质细胞以及LPS+Aβ诱导的BV2细胞mtROS的表达下降,使LPS+Aβ诱导的BV2细胞线粒体膜电位上升,改善线粒体动力学失衡(P<0.05)。(5)MSC能够抑制MAM介导的钙超载:MSC可以减少APP/PS1小鼠皮质小胶质细胞以及LPS+Aβ诱导的BV2细胞ER-线粒体的接触长度和MAM覆盖面积,使IP3R、GRP75和VDAC1的表达下降(P<0.05)。(6)MSC促进σ1R表达改善LPS+Aβ诱导的BV2细胞中MAM介导的钙超载和线粒体稳态失衡,驱动BV2细胞M1/M2表型转化发挥神经元保护作用:与LPS+Aβ+MSC处理组作用相反,BD1047和MSC联合使用后,BV2细胞线粒体钙含量升高,ER-线粒体的接触长度变长,MAM覆盖面积变大,IP3R、GRP75和VDAC1表达上升(P<0.05);Arg1、TGFβ表达下降,IL1β、iNOS表达升高,条件培养的SH-SY5Y细胞存活率和GAP43、PSD95的表达下降(P<0.05);mtROS表达增多,线粒体膜电位下降,线粒体动力学失衡(P<0.05)。结论:MSC通过促进σ1R表达抑制MAM介导的线粒体钙超载驱动小胶质细胞M2极化发挥AD神经元保护作用。