研究背景;类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性系统性自身免疫疾病,其特征病理改变为慢性滑膜炎。RA的发病机制仍不清楚,研究表明位于关节滑膜衬里层的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)在RA发病过程中扮演关键角色。其为一种“持续活化的细胞,,,具有与肿瘤细胞相似的特点,可表现为过度增殖,凋亡受抑,迁移及侵袭能力显著增CHIR-99021化学结构强,是关节破坏和关节炎症的关键因素,然而其生物学行为发生改变的机制尚不明确。近年来研究表明RA患者关节中高表达的TGFβ 1细胞因子可促进 RA-FLS 发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)促进滑膜炎症。长链非编码 RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt,不具有蛋白质编码能力的RNA分子,数量众多,在生物体体内分布广泛。近年研究表明LncRNA与RAFLS细胞的增殖、凋亡等病理过程相关。本研究拟对LncRNA在TGF M诱导的RA-FLS细胞EMT转化中的表达及调控作用进行研究,并对其在RA滑膜炎症过程中的作用及调控机制进行探索。第一部分 膝关节滑膜样成纤维细胞中TGF-β1通路相关LncRNA筛选目的1、检测TGF-β1刺激后RA-FLS与对照组中LncRNA表达谱,筛选差异表达的lncRNA 2、研究lncRNAITEpigenetics抑制剂GB8-AS1在体外培养的RA-FLS细胞中的表达及表型功能方法从膝关节置换手术、膝关节镜下滑膜切除手术取得RA患者膝关节滑膜组织,采用组织块贴壁法于体外原代培养FLS细胞。分别使用3例RA-FLS和3例TGF-β1刺激处理后的RA-FLS提取细胞总RNA,采用Human Super Enhancer LncRNA Array芯片进行lncRNA表达谱检测,获得在RA-FLS和TGF-β1刺激处理后的RA-FLS中差异表达的lncRNA。使用RT-qPCR检测、验证芯片筛选出的差异表达lncRNA,选择出现稳定差异表达的lncRNA作为研究靶点lncRNA。通过EdU、CCK8、体外侵袭、迁移实验等检测lncRNAITGB8-AS1在体外培养的RA-FLS中的功能。结果LncRNA芯片结果得出84个在RA-FLS和TGF-β1刺激处理后的RA-FLS中差异表达的LncRNAs(Fold change>2倍),其中在TGF-β1刺激处理后的RA-FLS中表达上调的LncRNA有47个,表达下调的有37个。挑选在RA-FLS中表达显著下调的LncRNA ITGB8-AS1作为研究对象。并在其他5例体外培养的RA-FLS中进行表达差异验证。通过使用腺病毒在RA-FLS中过表达LncRNAITGB8-AS1,及使用siRNA干扰LncRNA ITGB8-AS1的表达后,LncRNA ITGB8-AS1在RA-FLS中可以抑制其增殖、侵袭、迁移能力,但对其凋亡及细胞周期无影响。结论与RA-FLS相比,TGF-β1刺激处理后的RA-FLS中LncRNA表达谱出现明显改变。RA患者体外培养的RA-FLS中ITGB8-AS1表达下调,其可以抑制体外培养的RA-FLS增殖、侵袭、迁移能力,但对其凋亡及细胞周期无影响。第二部分 长链非编码RNAITGB8-AS1对CIA小鼠膝关节滑膜炎症的调控作用目的1、研究lncRNAITGB8-ASl对CIA小鼠膝关节滑膜炎症的影响2、初步探索lncRNAITGB8-ASl调控滑膜炎症的作用机制方法课题组前期研究证明LncRNAITGB8-AS1可结合蛋白FLNA,使用RIP在CIA小鼠膝关节滑膜组织中验证二者结合。构建胶原诱导关节炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)小鼠模型,向其膝关节腔内注射5型腺相关病毒过表达LncRNA使小鼠膝关节滑膜组织特异性表达LncRNA-ITGB8-ASl。通过观察记录小鼠爪垫厚度、膝关节直径、小鼠关节炎评分等监测小鼠炎症反应发展变化。脱钙后石蜡包埋小鼠膝关节组织,观察滑膜炎症情况。评估LncRNA在小鼠体内的作用。通过免疫印迹(Western blot)实验及免疫组织化学方法检测蛋白表达水平,利用G-LISA方法检测小鼠膝关节滑膜组织蛋白中RAC1蛋白活性。结果在CIA小鼠模型中,过表达ITGB8-AS1后,其膝关节滑膜组织炎症反应减轻,石蜡切片可见炎症细胞浸润减少,滑膜组织增生较对照组受到抑制。LncRNA ITGB8-AS1可与小鼠FLNA蛋白结合,抑制FLNA对小GTPase RAC1的激活,从而下调N-Cadherin、vimentin及α-SMA蛋白表达水平,即抑制RA-FLS细胞EMT作用,减轻CIMedical countermeasuresA小鼠膝关节滑膜组织炎症反应。结论LncRNAITGB8-AS 1在CIA小鼠膝关节中表达上调后,膝关节滑膜组织增生减弱、血管翳生成减少、淋巴细胞浸润减轻,同时软骨破坏减轻。LncRNAITGB8-AS1与FLNA蛋白结合抑制FLNA对RAC1的激活作用,进而调控滑膜样成纤维细胞的上皮-间质转化,发挥对滑膜炎症反应的抑制作用。