铜(copper,Cu)是生物体必不可少的微量元素,但是生物体内铜过载、缺乏、或因铜转运基因突变而导致的铜稳态代谢失MK-2206纯度衡,均会引发个体发育缺陷以及疾病的发生。然而,关于水环境铜过量或铜转运基因的突变导致鱼体内铜稳态代谢失衡进而影响鱼类造血系统发育及其潜在的调控机制仍知之甚少。本研究主要以斑马鱼(Danio rerio)为实验模型,对铜过载下斑马鱼的造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell,HSPCs)和T细胞发育缺陷及其潜在分子调控机制进行研究,并且对铜转运基因cox17突变后导致铜在体内分布失衡进而导致斑马鱼原始红细胞发育缺陷及其潜在调控机制进行深入的探究。主要研究结果如下:1.铜过载导致斑马鱼胚胎和幼鱼HSPCs增殖缺陷产生通过表型观察以及流式分析,发现铜胁迫斑马鱼HSPCs内铜含量升高及其增殖缺陷,并且foxm1-细胞周期/细胞骨架轴表达下调,细胞骨架蛋白表达下调并呈现紊乱分布。单独敲除foxm1或细胞骨架基因均可模拟铜过载胚胎中呈现的HSPCs增殖缺陷表型。而且,铜胁迫诱导HSPCs增殖缺陷及其调控机制从鱼类到哺乳类高度保守。机制上,本研究发现过载铜与转录因子HSF1和SP1直接结合,并且诱导了HSF1和SP1蛋白在细胞质聚集,导致HSF1和SP1在其下游基因FOXM1上的转录活性降低,以及FOXM1在HSPCs细胞骨架基因上的转录活性降低,最终导致HSPCs增殖受损。综上所述,斑马鱼HSPCs内铜过载诱导HSF1/SP1在细胞质聚集,导致foxm1-细胞周期/细胞骨架信号轴表达下调,最终阻碍HSPCs增殖。2.铜过载导致斑马鱼幼鱼胸腺T细胞凋亡及增殖缺陷产生通过鉴定铜胁迫斑马鱼造血系统的发育表型,本研究发现铜胁迫下斑马鱼幼鱼胸腺T细胞显著减少。铜过载诱导T细胞内ROS产生及foxos基因下调,过表达foxo3a可以有效地挽救铜胁迫下T细胞的减少。此外,与ROS-foxo信号轴平行的foxm1-细胞骨架信号轴也介导铜过载诱导的T细胞发育缺陷。同时,过载Cu诱导细胞产生的ROS破坏细胞骨架基因的表达但不会影响foxm1在细胞中的表达。综上,ROS-foxo/细胞骨架信号轴以及foxm1-细胞骨架信号轴共同参与了铜过载诱导的T细胞凋亡及增殖缺陷的发生。3.Multiplex Immunoassays铜转运基因cox17突变斑马鱼胚胎中原始红细胞发育本研究鉴定了铜转运基因cox17突变后引起的铜稳态代谢失衡对斑马鱼造血系统的影响。基因cox17突变影响了斑马鱼内原始红细胞的生成及其耐低氧能力,并影响了线粒体代谢功能。cox17~(-/-)突变体在受精后14 hpf,红细胞生成中的关键转录调控因子scl、lmo2和gata1a的表达显著降低,在受精后24 hpf,scl的表达仍然下调,而lmo2和gata1a的表达上调。机制上,本研究发现,cox17~(-/-)突变体表现出线粒体代谢受损,线粒体膜电位MMP、ATP和SAM含量以及SAM和SAH比值显著降低。线粒体氧化磷酸化解偶联剂CCCP处理野生型斑马鱼,可以模拟在cox17~(-/-)突变体中观察到的原始红细胞生成缺陷等selleck HPLC。此外,cox17~(-/-)突变体显示WNT信号显著下调,内质网应激显著上调,红细胞前体gata1a~+细胞中β-catenin表达降低以及WNT转录因子TCF4在scl及lmo2启动子上富集程度明显下调。综上,铜转运基因cox17突变导致斑马鱼胚胎细胞中线粒体功能障碍以及WNT-scl/lmo2信号轴下调,进而导致斑马鱼原始红细胞生成缺陷的发生。本研究,完善了铜过载导致的铜稳态代谢失衡下鱼类胚胎内HSPCs增殖缺陷及T细胞凋亡和增殖缺陷,以及铜转运基因cox17突变后导致的铜稳态代谢失衡下鱼类初始红细胞发育缺陷的分子调控的理论基础,也为铜稳态代谢失衡下鱼类免疫力低下和抗低氧能力低下提供理论依据。