研究目的:糖尿病联盟最新数据显示,我国糖尿病患病人数已居世界首位,为社会带来了承重的医疗和经济负担。糖尿病心肌病是糖尿病的常见并发症,致死率高。有氧运动已被证明是改善糖尿病心肌病的有效非药物治疗手段。铁死亡是由Dixon等于2012年发现并命名的一种新型细胞死亡方式。铁死亡具有铁依赖性,其主要通过破坏机体内谷胱甘肽(glutathione, GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathioneperoxidase4, GPX4)组成的抗氧化系统,使细胞膜脂质过氧化,细胞的正常结构受到破坏并因此死亡。已有研究证明铁死亡是糖尿病心肌病的发病机制之一。MOTS-c是一种线粒体衍生肽,已被发现可以在糖尿病大鼠心脏功能障碍中发挥与有氧运动相似的作用,可以作为一种有潜力的运动模拟物。另外,MOTS-c已被证明可以增加细胞内Nrf2易位入核的水平,具有抗氧化应激的作用,且具有显著的心脏保护作用。本研究拟建立2型糖尿病大鼠模型,对其进行中等强度有氧运动、外源性MOTS-c注射以及两者联合的干预,通过HE染色、透射电镜、超声心动图、生化检测、qPCR和western blotting等技术检测大鼠心脏的结构功能和铁死亡相关生化与分子指标,探讨铁死亡在MOTS-c和有氧运动改善糖尿病心脏功能障碍中的作用。研究方法:6周龄雄性SD大鼠83只,饲养于聚丙烯笼中,自由进食和饮水。环境温度控制在21～25°C,相对湿度保持在40～65%, 12小时明暗交替。首先将实验动物随机分为空白对照组(C,n=15)和糖尿病预造模组(pD, n=68)。C组大鼠以维持饲料喂养,pD组大鼠经高脂高糖饮食饲养6周后腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ,30mg/kg),72h后测定pD组大鼠的非空腹血糖。判定2型糖尿病大鼠造模成功的标准为:胰岛素抵抗基础上,血糖大于等于16.7 mmol/L。成模大鼠又随机分为糖尿病对照组(D,n=12)、糖尿病有氧运动组(DE,n=12)、糖尿病MOTS-cAZD1152-HQPA供应商注射组(DM,n=12)和糖尿病MOTS-c注射联合有氧运动组(DME,n=12)。DE和DME组大鼠首先进行持续三天的适应性跑步训练(坡度为0,速度为8m/min的状态运动5min,随后加速至10m/min继续运动10min)。正式运动方案为坡度0°,20m/min,60min/天,每周5天;MOTS-c注射剂量为0.5mg/kg/天,每周注射5天,共干预8周。使用酶联免疫吸附剂测定试剂盒检测胰岛素chronic antibody-mediated rejection,使用血糖仪测定大鼠血糖,运用比色法测定糖化血红蛋白。采用M型超声心动图检测大鼠心脏收缩和舒张功能的变化情况。采用HE染色与透射电镜观察心肌细胞结构和超微结构的变化。用比色法测定铁死亡相关生化指标(亚铁离子、MDA、GSH和GSH/GSSG)。使用流式细胞术测定心肌活性氧(ROS)含量。采用qPCR测定Atf3和Ptgs2mRNA表达,通过Western Blotting法测定Atf3、Ptgs2、Slc7a11、Gpx4和Mb蛋白表达。研究结果:(1)高脂高糖饮食喂养6周后,pD组大鼠在注射STZ前出现了空腹血糖非常显著升高(p<0.01)、空腹胰岛素分泌非常显著增多(p<0.01)与胰岛素抵抗指数非常显著升高(p<0.01)。pD组大鼠注射STZ的72h后再次检测其空腹血糖,有54只空腹血糖≥16.7mmol/L,成功达到糖尿病模型的标准,造模率约为79%;(2)运动和MOTS-c干预结束后,与C组相比,D组大鼠的体重均显著下降(p<0.05),FBG和HOMA-IR非常显著升高(p<0.01),GHb显著升高(p<0.05)。DME组大鼠体重显著升高(p<0.05),M组体重有所升高,但无统计学差异(p>0.05)。DE组大鼠FBG(p<0.01)、HOMA-IR和GHb降低(p<0.05), DM组大鼠的FBG、HOMA-IR和GHb也显著降低(p<0.05),DME鼠FBG、HOMA-IR和GHb均出现非常显著性降低(p<0.01);(3)与C组相比,D组大鼠心肌细胞间隙增加,心肌纤维间隙有较多脂质集聚,部分心肌细胞空泡变性及细胞核固缩,部分心肌肌纤维弯曲变形;另外,D组大鼠心肌线粒体嵴减少或消失,线粒体内部出现空泡现象,有较多线粒体体积缩小,部分线体膜破裂,而细胞核基本正常。与D组大鼠相比,DE、DM和DME组大鼠心肌纤维间隙脂质集聚减少,心肌纤维排列较为整齐,线粒体嵴增多、空泡减少,且线粒体基本恢复正常大小;(4)相比于C组,D组大鼠心脏EF值、E/A比值显著下降(p<0.05,p<0.01),而这两个指标在DE、DM和DME组大鼠中显著改善(EF:p<0.05,p<0.01,p<0.01;E/A:p<0.01,p<0.01,p<0.01);(5)与C组相比,D组大鼠心肌亚铁离子、ROS含量和MDA显著升高(p<0.01)显著升高(p<0.01),GSH和GSH/GSSG显著降低(p<0.01),Atf3和Ptgs2蛋白水平显著升高(p<0.01,p<0.05),Slc7a11、Gpx4和Mb蛋白水平显著下降(p<0.01,p<0.05,p<0.01)。与D组相比,DE组大鼠心肌亚铁离子无显著变化(p>0.05),ROS含量和MDA显著下降(p<0.05,p<0.01),GSH和GSH/GSSG显著上升(p<0.05),Atf3和Ptgs2蛋白表达显著下降(p<0.01),Slc7a11和Gpx4蛋白表达显著升高(p<0.05),而Mb蛋白表达有上升趋势,但无统计学差异(p>0.05)。DM组大鼠心肌亚铁离子显著升高(p<0.05),ROS含量和MDA显著下降(p<0.01),GSH和GSH/GSSG显著上升(p<0.05,p<0.01),Atf3和Ptgs2蛋白表达非常显著下降(p<0.01),Slc7a11、Gpx4和Mb蛋白表达显著升高(p<0.05,p<0.05,p<0.01)。DME组大鼠心肌亚铁离子显著升高(p<0.01),ROS含量和MDA显著下降(p<0.01),GSH和GSH/GSSG显著上升(p<0.01),Atf3和Ptgs2蛋白表达非常显著下降(p<0.01),Slc7a11、Gpx4和Mb蛋白表达显著升高(p<0.05,p<0.01,p<0.01)。研究结论:(1)有氧运动和MOTS-c均可明显改善糖尿病大鼠的血糖控制和胰岛素抵抗;(2)有氧运动与MOTS-c均可明显改善糖尿病心脏功能障碍;(3)有氧运动和MOTS-c干预均可通过Atf3-Slc7a11-Gpx4信号轴(降低Atf3的表达,提高Slc7a11和Gpx4的表达)减少心肌铁死亡,从而有效selleckchem KPT-330改善糖尿病心肌损伤,提升心脏功能。