目的尖锐湿疣主要是由低危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)持续感染导致的,其中超过90%以上的尖锐湿疣与HPV6和HPV11感染相关,因此需要建立一种简便、快速和准确的HPV6和HPV11检测方法。本研究建立含有内源性内参的重组酶介导的等温扩增技术(Endogenous internally controlled recombinaseaided amplification,EIC-RAA)的HPV6检测方法、HPV11检测方法、HPV6/11检测方法,并使用样本释放剂简化核酸处理步骤、缩短核酸提取时间。方法1参照RAA的设计原则分别在HPV6和HPV11的保守序列区域设计多条特异型引物和探针,将不同引物各自组合并与探针结合,使用重组质粒筛选出扩增效果最佳的引物探针组合并检测其灵敏度、重复性,使用其他HPV阳性临床样本的核酸检验其特异性,并对233例临床样本进行RAA检测,采用圣湘荧光PCR试剂盒法进行平行检测。2选取人β-球蛋白作为内参检测基因,将人β-球蛋白引物探针分别与RAA HPV6引物探针和RAA HPV11引物探针结合组成EIC-RAA检测方法,动态调整人β-球蛋白引lung biopsy物和探针的加入量优化EIC-RAA检测体系,通过使用其他HPV阳性临床样本的核酸检验其特异性,并对233例临床样本分别进行检测,采用圣湘荧光PCR试剂盒法进行平行检测。3使用Vector NTI软件将HPV6和HPV11的完整序列进行同源性比对,寻找一个相对保守的区段,在这个片段上设计通用型HPV6/11引物和探针,再结合人β-球蛋白引物和探针建立EIC-RAA HPV6/11检测方法,通过使用其他HPV阳性临床样本的核酸检验其特异性,并对233例临床样本进行检测,采用圣湘荧光PCR试剂盒法进行平行检测。4使用样本释放剂简化EIC-RAA检测前的核酸提取步骤,对使用条件的优化,建立样本释放剂结合EIC-RAA技术的检测法。使用该方法对233例临床样本进行核酸提取,平行进行磁珠法核酸提取,将分别使用2种方法提取的核酸进行EIC-RAA检测。结果1 HPV6-PF1R1和HPV11-PF1R1分别是RAA HPV6和RAA HPV11检测效果最佳的引物探针组合,使用最佳组合建立的RAA HPV6检测法和RAA HPV11检测法的检测灵敏度均为10copies/μL,重复性好,特异性高。与圣湘荧光PCR试剂盒法相比,RAA HPV6检测法和RAA HPV11检测法临床样本检测结果的符合率均为100%,Kappa值为1(P<0.001)。2 EIC-RAA HPV6和EIC-RAA HPV11的检测方法中人β-球蛋白引物和探针的最佳加入量为0.3μL和1.0μL,EIC-RAA HPV6检测方法检测灵敏度为10copies/μL,EIC-RAA HPV11检测方法检测HPV11的灵敏度为100copies/μL,重复性好,特异性高。与圣湘荧光PCR试剂盒法相比,EICRAA HPV6检测法和EIC-RAA HPV11检测法的临床样本检测结果的符合率均为100%,Kappa值为1(P<0.001)。3通过序列对比在保守的L1段设计通用型HPV6/11的RAA点击此处引物和探针,并建立EIC-RAA HPV6/11检测法,灵敏度为100copies/μL,重复性好,特异性高,与圣湘荧光PCR试剂盒法相比,EIC-RAA HPV6/11检测法的临床样本检测结果的符合率为100%,Kappa值为1(P<0.001)。4样本释放剂的最佳条件为200μL浓缩液和200μL原始样本添加量,2μL模板的添加量,LY2157299分子式与磁珠法相比,样本释放剂结合EIC-RAA方法的临床样本检测结果的符合率为100%,Kappa值为1(P<0.001)。结论本研究成功建立了EIC-RAA HPV6检测法、EIC-RAA HPV11检测法和EICRAA HPV6/11检测法,具有灵敏度高、特异性好、可信度高、操作简单的优势。并通过结合样本释放剂,使该方法具有快速和现场应用的优势,可在医疗资源有限的条件下对HPV6和HPV11感染进行现场检测,适用于基层社区医院的快速筛查。图6幅;表7个;参103篇。