肿瘤在体内形成、生长和转移的过程中常常伴随着蛋白和RNA等标志物的变化,此变化可在脑脊液、血液、胆汁和尿液等体液中监测到。因此,对体液中肿瘤标志物的高灵敏检测在癌症的诊断、预后、治疗和病因的认识等方面起着至关重要的作用。免疫分析是检测肿瘤标志物的常用方法,然而,其存在操作繁琐、耗时长和检测精度有限等缺点。因此,迫切需要开发简便、灵敏和特异性高的新型检测方法。近年来,荧光生物传感器因其操作简单、灵敏度高和可微量检测等优点在疾病诊断和生物分析中发挥重要作用。基于此,本论文以FEN1、microRNA-215和microRNA-21为研究对象,借助酶辅助的信号放大技术构建了三个荧光生物传感器,实现了对上述核酸及蛋白类肿瘤标志物的灵敏检测。具体研究工作如下:1.发光适配体的转录扩增用于FEN1的高灵敏和免标记检测分支核酸内切酶1(FEN1)是一种参与DNA复制和多种代谢途径的酶生物标志物,对癌症的早期诊断具有重要价值。在这项工作中,我们建立了一种基于发光适配体转录扩增的荧光策略用于FEN1的免标记、低背景和高灵敏检测。FEN1裂解双分支DNA复合物的5’-分支,形成含缺口的ds DNA,并在T4 DNA连接酶的作用下形成完全互补的ds DNA。随后,T7 RNA聚合酶识别双链启动子,启动转录扩增,产生大量孔雀石绿RNA适配体。获得的RNA适配体与染料“孔雀石绿”结合,产生显著放大的荧光信号,实现对FEN1的高选择性检测,检测限低至0.22 p M。此外,该方法还可以在稀释血清中实现对低浓度FEN1的检测,显示出其在早期癌症诊断中的潜力。2.目标物循环触发的聚合/异构化级联扩增用于microRNA的灵敏分析对microRNA这类生物标志物的定量分析有助于各种疾病的预测和诊断。在此,通过将目标物循环、聚合/异构化循环扩增(PICA)和CRISPR/Cas12a系统整合,构建了一种强大的级联信号放大方法用于灵敏检测microRNA-215。精心设计的可变引物与microRNA-215杂交,在逆转录酶的作用下触发目标物循环过程,产生大量发夹DNA。获得的发夹DNA在聚合酶和甜菜碱的作用下,启动后续的PICA反应,产生具有多个重复序列的长ss DNA,这些重复序列可以结合并激活Cas12a/cr RNA的反式切割活性,导致荧光猝灭的ss DNA报告分购买NVP-TNKS656子被切割,从而产生急剧放大的荧光信号,实现对microRNA-215的检测,检测限低至2.1 p M。此外,该传感方法可以选择性地将microRNA-215与其他干扰物质区分开,并在稀释后的血清中实现了对低水平microRNA-215的检测,显示了其在痕量水平上检测各种核酸类生物标志物的潜力。3.基于回文序列的级联和自循更多环引物延伸反应用于高灵敏检测microRNA-21MicroRNA-21是一种重要的生物标志物,参与了众多细胞过程,其在细胞中的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关。因此,准确监测其活性对生物医学研究和疾病诊断至关重要。本文构建了一种基于级联和自循环引物延伸(APE)扩增策略的荧光生物传感器用于microRNA-21的高灵敏检测。在我们的设计中,两个toehold介导的链置换反应(TSDRs)可以在microRNA-21和引物的存在下被激活,导致引物与基于DNA的复制和释放发夹(CRH)稳定结合,启动自循环引物延伸(APE)和链置换扩增(SDA)反应,产生大量G-四链体。获得的G-四链体可以与染料“Th T”相互作用,产生显著放大的荧光信号,完成对microRNA-21的高灵敏检测。受益于三重信号放大,该传感策略对microRNA-21的检测限低至0.32 p M。此外,该传感方法可以选择性地区分microRNA-21和其他干扰micrstructure-switching biosensorsoRNA,并在稀释后的血清中实现了对低水平microRNA-21的检测。该级联信号放大方法具有较宽的线性范围和较好的选择性,可作为一种可靠的早期癌症诊断手段。