研究目的:Cullin3(CUL3)是遗传性高血钾高血压,也称为Ⅱ型假性醛固酮减少症(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ),的重要致病基因之一selleck HPLC。目前为止,已发现17种CUL3突变与FHH有关,并且这些突变均导致了9号外显子(Exon 9)的跳跃。修正9号外显子异常剪接将有助于此类型PHAⅡ疾病治疗。基于此,本研究通过对2种致病性同义突变c.1221A>G(p.Glu407Glu)和c.1236G>A(p.Leu412Leu)剪接调控的深入研究,旨在进一步分析同义突变状态下CUL3Exon9剪接异常的发生机制,以及发现潜在的调控靶点,从而为PHAⅡ的个体化治疗提供帮助。研究方法:1.运用生物信息学在线软件Human Splicing Finder 3.0(HSF 3.0)预测c.1221A>G和c.1236G>A剪接调控的重要区域,以及与该位置结合的调控因子。2.合成生物素标记的RNA探针,和Hela细胞核蛋白进行RNA-Pull Down纯化和银染实验初步分析蛋白因子的分子量大小,采用质谱分析来进一步确定蛋白因子的种类和身份。3.采用RNA-Pull Down纯化后获得的目标蛋白进行蛋白质印迹法(Western blotting),来比较野生型和突变型探针结合蛋白之间的差异,确定反式作用因子与顺式作用元件结合的特异性。4.构建相关RNA结合蛋白过表达质粒,合成对应的小干扰RNA,与前期构建的p SPL3-CUL3 Exon9迷你基因共转染293T细胞,进一步验证相关的反式作用因子参与CUL3 Exon 9的剪接调控。5.采用定点突变的方法,将c.1221A>G和c.1236G>A上下游的碱基进行突变,在m RNA水平上验证外显子剪接增强子(exon splicing enhancers,ESE)和外显子剪接沉默子(exon splicing silencers,ESS)潜在的关键序列,并寻找一个可以挽救异常剪接的调控位点。6.拯救实验,合成双突变的生物素标记的RNA探针,采用RNA-Pull down纯化实验后进行Western blotting实验,验证双突变后RNA结合反式作用因子的变化。研究结果:1.HSF分析结果显示,突变c.1221A>G可能导致多种ESS基序的产生,与该ESS结合的反式作用因子可能为hn RNP A1(AAGAGG&GAGGTA)。预测突变c.1236G>A可能会破坏ESE(与SC35结合:GGATAAAG),并产生一个新的ESS(与hn RNP A1结合:TAGATA)。2.确定了差异性蛋白的分子量大小。银染的结果显示差异性蛋白条带主要集中在30-40k Da区域。根据质谱测序分析的结果筛选出以下蛋白进行Western blotting验证:hn RNP A1,hn RNP A2,hn RNP A3,hn RNP C,SC35,TRA2β,ASF/SF2和9G8。3.确定了野生型和突变型生物素探针结合的蛋白的身份和种类。结果显示了野生型(wide-type,WT1)和c.1221A>G(Mut1)都结合了hn RNP蛋白,但是Mut1结合的hn RNP A1,hn RNP A2,hn RNP A3和hn RNP C蛋白相对于WT1较多;WT1和Mut1在结合SC35,ASF/AF2,9G8和TRA2β上未见明显差异。野生型(WJQ1 IC50T2)探针和c.1236G>A(Mut2)探针的Western blotting结果显示,Mut2只结合了hn RNP A1和hn RNP A3因子,其他的反式作用因子均未在WT2中检测到。4.RNA干扰实验结果显示在单个si RNA的作用下,对Mut1的剪接无明显的影响;在联合多个si RNA的敲降作用下,发现Mut1的9号外显子包含的比例明显增加。下调hn RNP A1和hn RNP A3蛋白明显促进了Mut2外显子9的包含的比例。5.对于c.1221A>G位点,过表达hn RNP A1很大程度上促进了p SPL3-CUL3 E9-WT/Mut的外显子跳跃的比例;过表达hn RNP C蛋白促进了p SPL3-CUL3 E9-Mut的外显子跳跃比例,而对WT没有明显作用;过表达hn RNP A3后对p SPL3-CUL3 E9-WT/Mut的剪接作用都较弱。过表达hn RNP A1和hn RNP A3都很大程度上促进了c.1236G>A的外显子跳跃的比例。6.CUL3基因外显子9的第12-16各位点的突变均不同程度地引起了外显子9的跳跃,表明该区域存在ESE,也可能是突变以后产生了新的ESS。17-18位点的任何parenteral antibiotics碱基的替换都引起了外显子9的完全包含,说明这两个位点突变以后产生了较强的ESE,或破坏了较强的ESS。在G30A基础上的双突变实验中,发现外显子9的第27-32位点不同碱基的替代,均引起了一定程度上的外显子的包含。有趣的是,我们发现A18G位点对A15G和G30A造成的外显子跳跃的异常剪接都有一定的恢复作用。7.在蛋白水平上验证双突变探针A18G&A15G和A18G&G30A结合反式作用因子的变化。结果显示双突变以后显著地减少了对hn RNPs蛋白的结合,进一步证明了该突变位点A18G对外显子9跳跃的治疗有一定作用。实验结论:我们的研究首次探讨了PHAⅡ致病基因CUL3突变导致外显子9跳跃的分子机制,验证了:1.参与c.1221A>G exon 9剪接调控的是:hn RNP A1、hn RNP A2、hn RNP A3和hn RNP C复合体。2.参与c.1236G>A exon 9剪接调控的主要是:hn RNP A1、hn RNP A3。3.A18G位点作为理想的候选靶点,可以挽救突变导致的外显子跳跃的异常剪接,恢复外显子的包含,在个体化治疗上具有一定的意义。