禽致病性大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的、严重危害全球家禽养殖业的一类重要细菌性疾病。APEC血清群众多,所有日龄家禽均易感,APEC感染后会严重影响家禽生长性能,导致重大经济IDN-6556损失。APEC感染后,会引起败血症、组织器官炎症,包括:心包炎、肝周炎、气囊炎、关节炎、腹膜炎和脑炎等。APEC还能够通过受污染的禽肉和被家禽粪便污染的农产品传播给人类,导致尿路感染以及新生儿脑膜炎等,拥有人畜共患病的风险,对公共卫生安全造成严重影响。疫苗接种能针对APEC产生一定的保护效力,从而减少养禽业经济损失。目前APEC疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗等,但是由于存在相应的缺陷,导致目前临床未能普遍应用APEC疫苗。本研究是在利用实验室前期构建的一株表达APEC Ⅰ型菌毛的鸡伤寒沙门氏菌活载体疫苗候选株SG01Δ asd(pYA3342-APEC fim)的基础上进行了培养条件的筛选、动物攻毒剂量的筛选以及攻毒保护效力试验,为开发一种针对APEC感染提供较好攻毒保护效力的重组弱毒鸡伤寒沙门氏菌疫苗提供基础。1.重组鸡伤寒沙门氏菌活载体疫苗候选株SG01Δasd(pYA3342-APECfim)培养条件的初步探索。本实验针对实验室前期构建表达APEC Ⅰ型菌毛的活载体疫苗SG01Δ asd(pYA3342-APEC fim)株进行了培养条件的初步探索,针对其培养基种类和培养基pH值进行了筛选,并且对疫苗菌株的体外生长OD600 nm数值与其对应的活菌数建立了线性方程,以便快速评估菌液中的活菌数。试验结果显示,SG01Δ asd(pYA3342-APEC fim)疫苗候选株在pH为7.5左右的SOC培养基中,以180 rpm的转速振荡培养12 h能够获得较多活菌,最终能够达到3.5 × 109CFU/mL左右,以便后续试验的展开。2.禽致病性大肠杆菌APEC QD2(O78)强毒株攻毒剂量的筛选。为筛选APEC QD2(O78)medical herbs强毒株对21日龄雏鸡的合适攻毒剂量以满足后续攻毒保护试验的需要,本章将40只21日龄的SPF雏鸡随机分成了 4组:攻毒组A、攻毒组B、攻毒组C和健康对照组,每组各10只。其中攻毒组A、B和C组鸡群通过后胸气囊注射的方式注射APEC QD2(O78)强毒株,攻毒剂量分别为1 × 109 CFU/只、1× 108 CFU/只和1 × 107 CFU/只;健康对照组以相同的途径接种0.2 mL的无菌PBS溶液。在雏鸡攻毒后连续观察14天,并根据制定的评分标准对鸡群的精神状态和腹泻情况进行每日评分,最终根据发病标准进行判定。根据试验结果显示,攻毒组A发病率能够达到100%,死亡率为60%,攻毒组B和攻毒组C的发病率分别为80%www.selleck.cn/products/BIBW2992和60%,并未出现死亡。对死亡鸡进行剖检后发现,攻毒组A鸡群出现严重的心包炎和肝周炎,内脏表面出现一层黄色纤维素性膜,根据评分标准,心脏、肝脏和气囊的平均评分分别为1.90±1.10、1.40±1.26和0.60±0.84,与健康对照组存在显著性差异(p<0.05)。攻毒组B和攻毒组C临床症状轻微,其中攻毒组C的临床症状评分以及剖检病变评分与健康对照组不存在显著性差异。根据临床发病以及剖检结果显示,21日龄雏鸡合适的攻毒剂量为1 × 109 CFU,为后续的攻毒保护试验奠定基础。3.重组鸡伤寒沙门氏菌SG01Δ asd(pYA3342-APEC fim)株针对APEC QD2(O78)的攻毒保护效力评估。为了探索鸡伤寒沙门氏菌 SG01Δasd(pYA3342-APEC fim)株对 APECQD2(O78)的攻毒保护效果。本研究将40只5日龄SPF雏鸡随机分为4组:免疫组、免疫攻毒组、攻毒对照组和健康对照组,每组各10只鸡。SG01Δ asd(pYA3342-APEC fim)株通过口服途径免疫各组鸡群,每只0.2 mL,免疫剂量为1 × 109 CFU/只,首免两周和四周后以相同途径和剂量进行接种,共免疫三次。免疫后每周对免疫组进行采血,进行血清抗体凝集效价测定,血清抗体凝集效价检测利用实验室研发的S9HH(pBR322-APEC fim)凝集抗原。在免疫后每两周、攻毒后每周对免疫攻毒组、攻毒对照组和健康对照组进行称重。第三次免疫两周后以APEC QD2(O78)强毒株通过后胸气囊注射的方式进行攻毒,攻毒剂量为1 × 109CFU/只,0.2 mL/只,攻毒后连续观察14天,按照评分标准每天对三组鸡进行精神、腹泻评分,连续观察14天后对所有活鸡进行处死剖检并观察评分。根据试验结果显示,免疫后雏鸡平均日增重与健康对照组不存在显著性差异。通过对雏鸡组织器官的观察,结果显示不存在肉眼可见的病变,说明SG01Δ asd(pYA3342-APEC fim)株对雏鸡的生长性能无显著性影响,且不产生明显致病。根据血清抗体凝集效价的测定显示,在免后第一周就检测出血清抗体,并且逐渐升高,在免疫三周后,其中超过半数雏鸡的特异性菌毛凝集抗体滴度能够达到1:32(7/10),并一直维持在较高的水平。在APECQD2(O78)攻毒后,免疫攻毒组和攻毒对照组都出现相关的临床症状和剖检病变,攻毒对照组临床症状和脏器病理变化平均评分明显高于免疫攻毒组与健康对照组鸡群(p<0.05),攻毒对照组的发病率为100%(10/10),而免疫攻毒组的发病率为60%(6/10),发病率出现明显下降,上述结果表明,SG01Δ asd(pYA3342-APEC fim)株具有预防APEC QD2(O78)强毒攻毒感染SPF雏鸡的潜力。