细胞色素P450酶(P450s,CYP)是一类以血红素为辅基的金属酶。P450酶具有底物结构类型多样性和催化反应类型多样性,在天然产物合成的后修饰阶段可以选择特异性催化天然产物的官能团反应(如羟基化、环氧化等),拓宽了天然产物的结构复杂性和生物学功能多样性,使P450酶成为天然产物合成与修饰的有力工具。目前应用微生物宿主异源表达P450酶高效合成天然产物仍然存在一定的限制。主要包括:(1)P450酶在微生物宿主中异源表达效果不佳;(2)微生物宿主细胞内血红素供给不足;(3)细胞内血红素合成与P450酶表达不平衡;(4)辅酶的适配性以及辅因子需求限制了P450酶的催化效率。针对这些问题,本论文以大肠杆菌作为宿主,优化了P450酶的表达体系,通过理性改造血红素生物合成途径提高胞内血红素的供给,构建了可以精细调控血红素合成的工程大肠杆菌;利用胞内已有的辅因子结合还原伴侣工程及酶工程制备高效全细胞催化体系合成天然产物。主要研究内容和结果如下:(1)P450酶表达体系及血红素转运系统的构建。以经典的单组分P450 BM3_(A82F/A328F)(BM3mut)和三组分P450 sca-2G52S/T85F/F89I/T119S/P159A/V194N/D269E/T323A/N363Y/E370V(sca-2mut)为例,使用三种类型大肠杆菌BL21(DE3)、C41(DE3)和C43(DE3)组合两种不同拷贝数质粒(高拷贝数质粒pRSFDuet-1和中高拷贝数质粒p ETDuet-1)构建单组分P450酶和三组分P450酶最佳表达体系。通过比较选择了大肠杆菌C41(DE3)和高拷贝数质粒pRSFDuet-1作为P450酶最佳表达体系。单组分P450 BM3_(mut)以底物7-乙氧基香豆素的全细胞活性为29.3 U/g DCW;三组分P450 sca-2_(mut)以底物美伐他汀的全细胞活性为5.8±0.5 U/g DCW。在P450酶的最佳表达体系中,通过比较选择了过量表达来源E.coli Nissle1917的外膜血红素受体蛋白ChuA构建血红素转运系统,使用中低拷贝数质粒pCDFDuet-1表达chuA可以转运2.5 nM血红素至细胞内。使用含有强诱导启动子(T7lac)的中低拷贝数质粒pCDFDuet-1表达的血红素转运系统,单组分P450 BM3_(mut)以7-乙氧基香豆素为底物的全细胞活性提高了16.1%(34.1 U/g DCW);三组分P450 sca-2_(mut)以底物美伐他汀的全细胞活性提高了29.4%(7.5 U/g DCW)。(2)血红素合成途径改造增强胞内血红素供给。通过改造血红素生物合成途径进一步增强胞内血红素供应,通过比较质粒游离表达和整合表达改造血红素生物合成途径,最终选择了整合表达血红素生物合成途径中关键酶(谷氨酸-tRNA还原酶、谷氨酸-1-半醛氨基转移酶、胆色素原合成酶、胆色素原脱氨酶、尿卟啉原Ⅲ合成酶和亚铁螯合酶),并使用DNA支架组装关键限速酶胆色素原合成酶、胆色素原脱氨酶和尿卟啉原Ⅲ合成酶,工程大肠杆菌胞内血红素含量可提高至0.23～0.44 mg/L。与出发菌株C41(DE3)相比(0.01 mg/L),血红素合成能力提高23～44倍。应用工程大肠杆菌HEME-S13制备全细胞催化剂,单组分P450 BM3_(mut)全细胞活性提高了2倍(87.6 U/g DCW);三组分P450 sca-2_(mut)全细胞活性提高了2.8倍(21.9 U/g DCW)。(3)精细调控血红素合成平衡P450酶表达。通过比较和选择了来源于乳酸乳球菌的血红素转录因子HrtR及其结合序列HrtO构建大肠杆菌血红素生物传感器;通过对转录因子HrtR与血红素结合的关键氨基酸残基His-149进行饱和突变,得到了灵敏度比HrtR低的转录因子HrtR_(H149k);结合调控s RNA和血红素传感器精细调控血红素生物合成,基于此,工程大肠杆菌HEME-R11胞内血红素水平可以控制在0.06～0.12 mg/L。应用工程大肠杆菌HEME-R11菌株制备全细胞催化剂,单组分BM3_(mut)纯酶中血红素含量(mol血红素/mol BM3_(mut))由出发菌株C41(DE3)中的17.7%提升至71.5%,全细胞活性较出发菌株C41-pRSF-BM3_(mut)提高了3.3倍(125.9 U/g DCW);三组分P450 sca-2_(mut)的表达水平较出发菌株C41-pRSF-sca-2_(mut)-CAB相比提高79.7%,三组分P450 sca-2_(mut)纯酶中血红素含量(mol血红素/mol sca-2_(mut))由出发菌株C41-pRSF-sca-2_(mut)-CAB的12.9%提升至61.8%,全细胞活性较出发菌株提高了6.9倍(45.4 U/g DCW),对美伐他汀的转化率为68.4%,是文献报道最高转化率的1.3倍(53.9%)。(4)高效P450酶全细胞催化剂合成羟基化黄酮天然产物。应用可以精细调控血红素合成的工程大肠杆菌HEME-R11制备全细胞催化剂合成天然产物。与出发菌株C41(DE3)相比,应用大肠杆菌HEME-R11制备单组分P450 BM3_(mut)催化剂,催化香豆素、白藜芦醇分别合成3-羟基香豆素和白皮杉醇的效率分别提高了290%和80%。在对三组分P450 sca-2_(mut)的研究中,挖掘P4此网站50 sca-2_Secretase抑制剂(mut)具有突出的黄酮羟基化活性,通过挖掘使用还原伴侣大肠杆菌黄素氧还蛋白Fld和黄素氧还蛋白还原酶Fpr、酶工程获得突变体sca-2_(mut)R88A/S96A以及优化全细胞催化反应条件,运用工程大肠杆菌HEME-R11制备高效sca-2_(mut)R88A/S96A全细胞催化剂,催化终浓度为100 mg/L的柚皮素、二氢山奈酚、山奈酚、芹菜素、大豆苷元分别合成圣草酚、二氢槲皮素、New genetic variant槲皮素、木犀草素和7,3′,4′-三羟基异黄酮的转化率为80.6%、66.3%、5.7%、31.8%和75.1%。