肺部疾病(lung diseases)是最常见的死亡原因之一。研究发现肺炎患者有着高心血管疾病风险,血栓性疾病(PD-0332991使用方法Thrombotic disease)也是新型冠状病毒肺炎的主要并发症之一,但在其他肺部疾病中的风险尚不清楚。为评估肺部疾病患者发生血栓性疾病的风险,本论文通过基因工程和小鼠杂交瘤技术,分别制备了针对血栓调节蛋白(TM)和组织型纤溶酶原激活剂-抑制剂复合物(tPAIC)的单克隆抗体,然后将抗体结合磁微粒和化学发光免疫检测技术,开发了检测范围广、稳定性好、检测快速、检测结果精准的TM、tPAIC检测方法。最后收集临床肺部疾病样本进行检测,评估肺部疾病的血栓形成风险。主要研究内容如下:1、以人肝脏c DNA为模板,扩增TM、t-PA、PAI-1基因。将TM基因连接pCMV3-C-his表达载体后转染HEK-293F细胞,表达并纯化TM蛋白。将t-PA和PAI-1基因分别连接p ET-28a表达载体后转染BL21(DE3)细胞,诱导表达并纯化t-PA、PAI-1后,使用t-PA和PAI-1体外合成tPAIC并纯化。以重组蛋白TM、tPAIC作为免疫原注入小鼠,四免后选取效价最高的小鼠制备杂交瘤细胞并亚克隆。通过筛选杂交瘤细胞株,得到一对针对TM的抗体和一对针对tPAIC的抗体。最后,通过制备小鼠腹水,扩大生产抗体并通过protein G亲和层析柱纯化。2、使用自制TM、tPAIC抗体,以双抗体夹心检测原理结合磁微粒和吖啶酯化学发光技术,建立TM、tPAIC化学发光免疫检测方法。通过条件优化,TM和tPAIC磁珠包被p H分别为8.0和9.0;每毫克磁珠的抗体投入量分别为15μg和20μg;封闭时间分别为12 h和16 h;抗体吖啶酯投料质量比分别为25:1和20:1;选择一步检测法作为反应模式,结合全自动发光仪,综合检出时间为17min。随后对TM、tPAIC检测方法进行性能验证,结果显示TM、tPAIC检测方法的空白检测限(LOB)分PEG300 molecular weight别为0.330 TU/m L和0.361 ng/m L;检测限(LOD)分别为0.372 TU/m L和0.398 ng/m L;TM检测在<240 TU/m L的范围内具有线性,tPAIC检测在<160 ng/m L的范围内具有线性;37℃加速10 d,稳定性的偏差均小于17%;回收率偏差均小于±10%;与市面上主流厂家A的方法学比对相关系数R均大于0.975;重复性、精密度的变异系数(CV)均小于5%;常见干扰物、HOOK效应对检测结果无影响;TM的参考区间为1.08-13.47 TU/m L,tPAIC男性参考区间为1.85-15.91 ng/m L,女性参考区间为1.9-9.43 ng/m L;部分性能如检测范围、精密度、重复性、反应速度等优于比对产商A。3、本论文收集354例临床样本,并Autoimmune disease in pregnancy根据临床诊断结果分为健康组、肺部感染组和肺部肿瘤组3个人群,并使用TM、tPAIC检测方法,结合其他4项血栓标志物与4项炎症标志物进行检测。结果表明,TM的水平在各类肺病患者样本中显著升高,表明肺病患者存在内皮细胞损伤;肺部感染、肺炎、慢性阻塞性肺病、肺部阴影等患者,炎症标志物显著升高,患者体内存在炎症和免疫反应;肺癌、肺部感染、肺炎等患者FDP、D-Dimer水平显著上升,表明患者具有血栓形成的风险;带有感染和炎症的肺部疾病可能促进人体纤溶系统的激活;血栓标志物和炎症标志物的各测试结果之间,并不存在具有临床意义的相关性;通过绘制ROC曲线,发现当截断值设定为24.51 TU/m L时,诊断重症肺炎的灵敏度为62.5%,特异度为82.4%,其ROC曲线下面积为0.781,表明TM具有从普通肺炎中诊断重症肺炎的潜力。