目的:本研究在蒙医基础理论的指引下采用随机不可预见性应激结合孤养法制备慢性应激抑郁大鼠模型,通过观察大鼠行为学改变、神经递质以及肠道菌群多样性与丰富度的变化来探讨蒙药肉蔻五味丸的抗抑郁作用机制。方法:(1)分组将84只SPF级健康雄性SD大鼠在温湿度适宜的饲养室适应性饲养一周后随机分为空白对照组、模型组、蒙药肉蔻五味丸(低、中、高剂量及提取物组)组和氟西汀西药组,每组12只大鼠。空白对照组大鼠6只为一笼饲养,其余各组大鼠均单笼孤养。(2)模型的制备每天随机给予1种刺激,主要包括禁食24h、禁水24h、高速水平震荡15min、潮湿垫料24h、4℃冷水游泳5min、45℃热刺激5 min、夹尾1min、昼夜颠倒12h、噪音2h等,采用这种随机不可预见性应激结合孤养法制备慢性应激抑郁大鼠模型。每日观察并记录大鼠体重状况、毛色光泽、精神状态、活动度等情况。(3)给药方法空白对照组大鼠不做任何干预,自由进食、饮水。造模第一天开始对各组大鼠进行灌胃给药。模型组给予纯净水,按10ml/kg灌胃。蒙药肉蔻五味低、中、高剂量(0.4g/kg、0.8g/kg、1.6g/kg)组大鼠每天分别在造模前1h按10ml/kg灌胃,蒙药肉蔻五味提取物组(0.1g/kg)大鼠每天分别在造模前1h灌胃;氟西汀组(3.6mg/kg)大鼠每天造模刺激前1h按10ml/kg灌胃给药。每日固定时间给药,连续28天。(4)观察指标及检测方法采用测体重、旷场试验、糖水实验和Morris水迷宫实验评价行为学改变。采用酶联免疫法(ELISA)测定海马5-羟色胺(5-HT)、5-羟色氨酸(5-HTP)、色氨酸羟化酶2(TPH2)、5-羟色氨受体4(5-HT4)、乙酰胆碱(ACh)等的水平,血清中测色氨酸(TRP)、5-羟色氨酸(5-HTP)、色氨酸羟化酶1(TPH1)、皮质醇(CORT)、干扰素-γ(IFN-γ)含量,心脏中测5-羟色氨受体4(5-HT4)、钙离子(Ca~(2+))、乙酰胆碱(ACh)的含量。采用16Sr DNA高通量测序技术检测大鼠粪便中的肠道菌群,分析各组大鼠菌群的多样性及丰度。结果:(1)行为学测定体重变化方面,实验开始前各组大鼠的体重几乎没有区别。做实验的14d、21d和28d把空白组和模型组的体重进行比较,发现模型组的体重增长率明显低于空白组(P<0.05)。造模期间,与空白组相比,各组实验大鼠的体重增长率下降明显;实验的21d,与模型组比较,肉蔻五味丸提取物组和西药组的体重明显升高(P<0.05);实验的28d,与模型组比较,肉蔻五味丸提取物组、高剂量组、中剂量组和西药组的体重明显升高(P<0.05),肉蔻五味丸低剂量组的体重有升高但差异没有统计学意义(P>0.05);糖水消耗率方面,实验开始前测糖水消耗率,各组实验大鼠的糖水消耗率之间基本都没区别。造模期间,与空白对照组比较,模型组大鼠糖水消耗率明显低于空白组,其中实验14d、21d、28d为糖水消耗率显著降低(P<0.05)。与模型组比较,肉蔻五味丸各剂量组和西药组的糖水消耗率明显改善,其中实验14d时与模型组比较肉蔻五味丸高剂量组、中剂量组、提取物组和西药组糖水消耗率显著增加(P<0.05),实验21d、28d时与模型组比较肉蔻五味丸高剂量组、中剂量组、低剂量组、提取物组和西药组糖水消耗率显著增加(P<0.05)。旷场活动方面,实验的第28天给完药后与空白组相比,模型组大鼠的水平跨越网格数及直立数目均明显减少(P<0.01)。与模型组比较,肉蔻五味丸提取组大鼠的垂直活动次数显著增加(P<0.05),肉蔻五味丸高剂量组、肉蔻五味丸中剂量组、肉蔻五味丸提取物组和西药组大鼠水平穿越格数显著增加(P<0.05)。学习和记忆能力方面,实验第28天给完药后,与空白组比较,模型组逃避潜伏期显著增加(P<0.05),目标象限停留时间百分比显著降低(P<0.05)。与模型组比较,肉蔻五味丸提取物组,肉蔻五味丸高剂量、中等剂量及西药治疗后,大鼠逃逸潜伏期明显缩短(P<0.05),靶象限滞留时间百分率明显延长(P<0.05)。肉蔻五味丸低剂量组的逃避潜伏期也降低,目标象限停留时间百分比增加,但差异无统计学意义。(2)肉蔻五味丸对各组大鼠海马中5-HT、TPH2、5-HTP、5-HT4、ACh的影响:实验结果显示,与空白组相比,模型组大鼠海马中5-HT、TPH2、5-HTP、5-HT4、ACh的含量均显著降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,肉蔻五味丸高剂量组、肉蔻五味丸提取物组和西药组海马中5-HT、TPH2、5-HTP、5-HT4、ACh的含量均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。肉蔻五味丸中、低剂量组大鼠海马5-HT、TPH2、5-HTP、5-HT4、ACh的含量与模型组相比无显著差异。(3)肉蔻五味丸对各组大鼠血清中IFN-γ、5-HTP、TRP、CORT、TPH1的影响:实验结果显示,与空白组相比,模型组大鼠血清中5-HTP、TRP、TPH1的含量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),血清中干扰素-γ和CORT浓度明显升高,两组比较有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,肉蔻五味丸高、中剂量组、moderated mediation肉蔻五味丸提取物组和西药组血清中IFN-γ、CORT的含量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。肉蔻五味丸高剂量组、肉蔻五味丸提取物组和西药组血清中5-HTP、TRP、TPH1的含量均显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)肉蔻五味丸对各组大鼠心脏中5-HT4、Ca~(2+)、ACh的影响:实验结果显示,与空白组相比,模型组大鼠心脏中5-HT4、selleck PUN30119Ca~(2+)、ACh的含量均,显著降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,肉蔻五味丸提取物组心脏中5-HT4、Ca~(2+)、ACh的含量均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)16Sr DNA高通量测序技术分析使用16Sr DNA测序对大鼠Alpha多样性和丰富度进行分析,CUMS模型组大鼠chao1指数显著降低,表明群落丰富度降低,Shannon、Simpson指数都降低,表明群落多样性降低,提示慢性应激降低了大鼠肠道菌群的丰富度和多样性。样本的goods＿coverage指数都1,说明测序结果可以代表样本的真实情况。各组大鼠肠道菌群物种结构分析各组大鼠肠道菌群在门水平物种的组成,与空白对照组相比,CUMS模型组大鼠的厚壁菌门所占比例显著降低(P<0.05),拟杆菌门所占比例显著增加(P<0.05),变形菌门所占比例显著增加(P<0.05)。与模型组相比,肉蔻五味丸组大鼠的拟杆菌门、变形菌门(P<0.05)所占比例显著降低,厚壁菌门所占比例显著升高(P<0.05)。各组大鼠肠道菌群属(Genus)水平物种相对丰度分析结果:与空白对照组相比,模型组大鼠的罗姆布茨均属所占比例显著增加(P<0.05)。与模型组相比,肉蔻五味丸组大鼠的乳酸杆菌属占比例显著增加(P<0.05),别样棒菌属、罗姆布茨均属所占比例显著降低(P<0.05)。结论:(1)不可预见性慢性应激结合孤养可诱导大鼠抑郁样行为学改变。使用肉蔻五味丸后,应激抑郁大鼠的行为有了明显的好转。(2)肉蔻五味丸对抑郁模型大鼠海马5-HT具有调控作用,其机制可能与提高海马组织中TRP、5-HTP、TPH2的含量有关。(3)肉蔻五味丸对抑郁模型大鼠心脏5-HT4、Ca~(2+)、ACh与海马组织中5-HT4、ACh具有调控作用,其机制可能与提高血清中TRP、5-HTP含量从而使5-HT与5-HT4结合增加有关。(4)用肉蔻五味丸有效增加慢性应激抑郁模型大鼠血清5-HTP、TRP、TPH1含量,降低血清IFN-γ、CORT含量。认为肉蔻五味丸抗抑郁作用可能与调节机体内IFN-γ、CORT、5-HTP、TRP、TPH1含量相关。(5)肉蔻五味丸对肠道菌群的数量及种类的调整有益。认为肉蔻五味丸通过调节肠道菌群多样性与丰富度,改善行为和情绪是肉蔻五味丸可能的抗抑郁机制。综上所述,肉蔻五味丸可能通过改善紊乱的肠道菌群,一方面减少机体内IFN-γ、CORT的含量,并提高血清TRP、5-HTP、TPH1的含量,另一方面增加心脏上5-HT与5-HT4的结合并调控Ca~(2+)、ACh,从而提高海马TRPwww.selleck.cn/products/Paclitaxel(Taxol)、5-HTP、TPH2进而增加海马5-HT的含量,认为肉蔻五味丸的抗抑郁作用基于肠-脑轴,调节肠道菌群从而实现脑内神经递质水平的升高。我们的研究丰富了肠道菌群及肉蔻五味丸的研究内容,旨在为未来肉蔻五味丸的进一步研发提供依据。