目的:本研究以京大戟醇提物为示例药物,以佐剂性关节炎大鼠和正常大鼠为研究对象探讨京大戟对佐剂性关节炎模型大鼠和正常大鼠的疗效及毒性;运用网络药理学方法预测京大戟95%乙醇提取物抗类风湿关节炎的作用靶点及信号通路;并通过动物实验对与类风湿关节炎相关核心靶点进行验证;利用16Sr DNA高通量测序分析京大戟对佐剂性关节炎模型动物肠道菌群变化的影响,为其临床安全合理应用和进一步研究开发提供科学依据。方法:1.采用网络药理学方法,收集京大戟95%醇提物有效成分并筛选相应的作用靶点,搜寻与RA疾病相关的靶点,构建“药物-有效成分-作用靶点”网络,基于PPI数据库构建京大戟成分靶点疾病相关靶点之间的网络,并根据节点的2倍中位数筛选关键靶点,采用Metascape平台分析靶点关联的主要GO与KEGG,分别进行通路富集分析,利用分子对接软件将与疾病相关的前10位核心靶点与对应的前10位化学成分进行分子对接。2.按照随机数字法将54只健康SD雄性大鼠分为6组,分别为空白组、模型组(adjuvant-induced arthritis,AA)、阳性雷公藤多苷片组(9mg/kg)、模型给药高剂量组(360.4mg/kg)、模型给药中剂量组(180.2mg/kg)、模型给药低剂量组(90.1mg/kg)。适应性饲养七天,复制大鼠佐剂性关节炎模型,连续治疗给药4周,观察模型给药各组大鼠足跖肿胀度,ELISA法检测血清中有关指标的影响,并进行足趾滑膜组织病理学检查。3.SD大鼠81只,分为9组,分别为正常组、模型组、阳性组(9mg/kg)、模型给药高、中、低剂量组(360.4mg/kg、180.2mg/kg、90.1mg/kg)、正常给药高、中、低剂量组(360.4mg/kg、180.2mg/kg、90.1mg/kg),除正常和模型组给予相应药物,观察并对比京大戟对模型给药组与正常给药组给药4周后毒性特点及毒性靶器官。4.肠道菌群分析:实验结束后收集大鼠粪便,以16S r RNA 341F-806R区进行测序。探讨京大戟对类风湿关节炎(AA)大鼠肠道菌群的影响。结果:PI3K抑制剂1.网络药理学实验结果显示,从京大戟中筛选得到的25个活性成分,进而得到376个成分靶点,疾病数据库搜索到5017个类风湿关节炎疾病靶点,成分-疾病靶点取交集后229个。化合物-交集靶点拓扑分析得知7,4’一二羟基二氢黄酮(degree=73)、芹菜素(degree=71)、山柰酚(degree=66)、鼠李素(degree=66)、槲皮素(degree=65)、邻苯二甲酸二丁酯(degree=61)、7-羟基香豆素(degree=4Cloning and Expression Vectors6)、鞣花酸(degree=41)、大戟醇(degree=39)、甘遂甾醇(degree=38)在网络中占主导地位。PPI网络拓扑分析结果显示,TNF、AKT1、SRC、EGFR、MMP9、ERBB2等43个靶蛋白为较为核心蛋白。交集靶点涉及1944个生物学过程,200条KEGG通路(p<0.01),京大戟主要通过调控癌症的通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、T细胞受体等信号通路来达到治疗RA效果。2.京大戟醇提物对AA大鼠治疗作用研究结果显示:(1)足趾的肿胀度:与正常组相比,大鼠造模组均足肿胀度显著升高(p<0.01),与模型组相比各治疗组均呈现不同程度的消肿作用(p<0.05),其中高剂量组消肿效果最好,且效果呈剂量相关性。(2)酶联免疫测定结果:与正常组比较:模型组RF、TNF-α、CD4、CD25、IL-2、MMP-9、IFN-γ显著升高(p<0.05或p<0.01),CD8、IL-10、TGF-β降低(p<0.05或p<0.01)。与模型组相比各治疗组RF、TNF-α、CD4、CD25、MMP-9、IFN-γ均降低(p<0.05或pLiproxstatin-1试剂<0.01)、IL-10、TGF-β升高(p<0.05),京大戟中、低剂量组IL-2降低(p<0.05),高、中、低、剂量组CD8升高(p<0.05)。(3)HE滑膜病理结果:正常组滑膜细胞单层排列、无增生,未发现炎性细胞;模型组踝关节滑膜组织增生,有大量炎细胞浸润且关节腔内有炎性渗出,骨量严重流失;经治疗后滑膜细胞增值情况明显好于模型组,炎性细胞浸润、软骨侵蚀、滑膜增生及血管翳形成等病变均有不同程度的好转。3.京大戟醇提物的毒性作用研究结果显示:(1)对生化指标的影响:与正常组比较,模型给药高、正常给药各剂量组AST升高(p<0.01或p<0.05);正常给药各剂量组ALT升高(p<0.01或p<0.05);正常给药中剂量组UREAL升高(p<0.05);模型给药高剂量组CREP升高(p<0.05)。(2)对脏器指数的影响:与正常组比较,正常给药各组心、肝脏指数升高(p<0.01或p<0.05);阳性组肺脏指数升高(p<0.05);阳性组、模型给药低剂量组、正常给药各组肾脏指数升高(p<0.01或p<0.05);模型组脾脏指数降低(p<0.05),与模型组比较,模型给药中、低剂量组脾脏指数升高(p<0.01或p<0.05)。4.16sr DNA高通量测序结果:与正常组比较,模型组差异菌为芽孢杆菌目、放线菌目、耐盐咸海鲜球菌、葡萄球菌科、巴斯德氏菌目、巴氏杆菌科、嗜粘蛋白-阿克曼氏菌、疣微菌目、疣微菌门、疣微菌科、奇异菌属、丁酸弧菌属、嗜血杆菌属等13个差异菌,而给药组差异菌有苏黎世杆菌目、苏黎世杆菌属、苏黎世杆菌科、棒状杆菌属、棒状杆菌科、气球菌科、费克蓝姆菌属、奈瑟氏菌科、奈瑟菌属、奈瑟菌目、颤杆菌克属、动球菌科、芽孢八叠球菌属、毛绒厌氧杆菌属等14个差异菌。结论:京大戟醇提物能明显改善AA大鼠足趾肿胀度和滑膜病理改变,调节AA大鼠血清中TNF-a、RF、IL-2、MMP-9、CD4、CD8、CD25、TGF-β、IFN-γ、IL-10等细胞因子的水平,故京大戟对佐剂性关节炎大鼠具有明显的治疗作用;其机制可能通过7,4'一二羟基二氢黄酮、芹菜素、山柰酚、鼠李素、槲皮素、邻苯二甲酸二丁酯、7-羟基香豆素、鞣花酸、大戟醇、甘遂甾醇等25个活性成分作用到TNF、AKT1、SRC、EGFR、MMP9、ERBB2等43个靶蛋白通过癌症通路、MAPK、PI3K-Akt、T细胞受体、TNF等核心通路直接起到作用或作用机制可能为苏黎世杆菌目、苏黎世杆菌属、苏黎世杆菌科、棒状杆菌属、棒状杆菌科、气球菌科、费克蓝姆菌属、奈瑟氏菌科、奈瑟菌属、奈瑟菌目、颤杆菌克属、动球菌科、芽孢八叠球菌属、毛绒厌氧杆菌属等14个差异菌来回调肠道细菌活性来调节AA大鼠体内类风湿因子RF,炎症细胞因子TNF-a、IL-2,T细胞相关因子CD4、CD8、CD25,B细胞相关因子TGF-β、IFN-γ、IL-10等的含量进而发挥抗RA作用,缓解大鼠足趾肿胀度及滑膜病理改变。京大戟毒性靶器官为肝、肾,且正常状态下给药毒性大于病症状态下给药。