目的:中药活性成分研究是先导化合物发现和新药研究的重要源泉。中药当中包含许多成药的明星分子,羟基酸是生物活性分子、小分子药物及天然产物中非常重要的一类结构单元,其中手性羟基引入方法是合成此类化合物急需解决的问题。而合成生物学作为一个新兴学科,是当前科学研究的热门,通过利用Protein-based biorefinery分子生物学和基因编辑等技术设计构建反应路径,通过高通量检测和AI学习优化重构线路发展,成为一个有机的进化整体。是解决天然产物丰度低,化学合成难的有效手段之一,生物合成途径解析,非天然氨基酸切块的生物合成,酶法后修饰应用等为天然产物的开发和应用提供新的技术。而我们也设想探索酶促反应方法及机制,合成羟基酸类化合物。所以构建高效的合成技术对药物和中药活性成分研究的绿色生物制造至关重要。本论文旨在开发建立具有高立体选择性、高区域选择性、高效率的不对称羟基化绿色合成技术。方法:本论文发现了一类α-KG依赖性的非血红素铁双加氧酶亚家族的非天然催化活性,该酶家族成员具有催化二级或三级C(sp~3)–H键的区域立体发散性氧官能化的多样功能。经过大肠杆菌异源表达,蛋白纯化,酶活测定,反应条件优化,底物与酶的二维筛选扩大适用范围,产物表征以及克级制备应用,通过单晶培养及旋光测试确定手性构型。利用计算机辅助分子对接及分子动力学模拟解释反应可能的机制及不同的选择性。最终获得的不对称羟基化产物对新冠病毒Mpro/3Clpro进行抑制活性和IC_(50)值测试。结果:本论文通过酶促反应开发建立了一套高立体选择性、高区域选择性、高效率的绿色不对称羟基合成技术。同时开发了连续不对称双羟基化合成方法技术,分别可以从苯甲醛及苯丙酸类底物出发经酶级联反应获得双羟基化产物。实现了4种单羟基化反应类型共计92个羟基酸的高效不对称合成,其中64个新化合物;2种双羟基化反应共计38个双羟基化产物,30个新化合物。大部分产物的ee>90%,de>95%;极大地丰富了该类化合物的物质基础,同时为该类化合物的合成、纯化、分析、检测建立了一套行之有效的方法。本论文的部分单羟基化和双羟基化产物具有一定的抗新冠病毒活RP56976溶解度性,其中双羟基化产物的抗新冠病毒活性优于单羟基化,可作为新型冠状病毒(2019-n Co V)Mpro/3CLpro抑制剂的活性化selleck HPLC合物进一步研究。结论:本论文通过酶促反应开发了高立体选择性、高区域选择性、高效率的不对称羟基绿色合成技术。通过灵活调整催化剂与底物的组合实现区域选择性不对称单羟基化反应,绘制了底物与酶相互反应的相关“二维谱图”;通过理论计算解释了区域选择性及立体选择性的差异,为该类酶进一步应用提供理论指导。并通过位点选择性互补催化剂的组合实现了可控的酶级联不对称双羟基化反应,构建了手性小分子羟基酸化合物库。本论文希望该酶促羟基化反应技术能够用于非天然手性小分子片段的构建和活性天然产物分子或药物分子的后期不对称修饰,服务于中药活性天然产物等小分子化合物的不对称合成,改善小分子的理化性质,为药物开发提供物质基础。