【背景】嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR T)疗法是血液系统恶性肿瘤领域最重要的突破之一。目前自体CAR T细胞疗法已被美国Food and Drug Administration批准作为大B细胞淋巴瘤的二、三线治疗。但由于多数患者在经历多线化疗后常出现淋巴细胞缺乏及功能障碍等;同时自体CAR T细胞的制作是个体化的,等待周期长,部分患者在等待自体CAR T细胞的过程中出现疾病进展或治疗相关的并发症,因而失去输注CAR T细胞的机会;最后,每个个体的自体CAR T细胞都需要单独的制备流程,使得自体CAR T细胞费用非常高昂难以承受。这些因素影响了自体CAR T细胞疗法对患者的治疗,同时阻碍了自体CAR T细胞疗法的广泛应用。“现成”的异体CAR T细胞疗法可有效的解决以上的问题,但异体来源的供者T细胞移植可能会导致危及生命的移植物抗宿主病(Graft-Versus-Host Disease,GVHD),同时容易被宿主免疫系统识别消灭。目前通用型CAR T细胞主要来自健康供者的外周血单核细胞,少数来自脐带血(Cord Blood,CB)。既往的研究显示,CB异体移植显示出有效的抗肿瘤作用,同时具有较低的复发率和GVHD发生率。在不依赖抗原的刺激下,活化的CD8+CB T细胞比来自外周血(Peripheral Blood,PB)的T细胞表现出更强的增殖能力;在抗原刺激后,这些幼稚的CB T细胞可以表现出细胞毒性效应。另外CB来源稳定。因此我们认为CB来源的T细胞可能是CAR T细胞的有效来源。因此,探索CB作为通用型CAR T细胞有效来源,同时构建有效的并安全的CB来源的CAR T细胞疗法对提高血液系统恶性肿瘤患者免疫治疗的疗效和适应症至关重要。【研究目的】研究表明,CB以其独特的生物特性,具有成为通用型CAR T细胞的最佳来源的潜力,并提供一种“现成的”细胞治疗产品。因此,探索CB作为通用CAR T细胞疗法的潜力以及验证其在弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma,DLBCL)中疗效,对深入理解和促进CAR T细胞疗法的广泛应用至关重要。【方法】1、构建CB CD19-CAEastern MediterraneanR T细胞(1)根据既往文献报道的序列信息,构建CD19-CAR基因(CD19sc Fv-CD8-4-1BB-CD3),并克隆至慢病毒载体质粒。(2)从CB中提取出T细胞,利用慢病毒载体质粒将CD19-CAR基因转染进CB T细胞内,构建CB来源的靶向CD19的二代CAR T细胞,用流式细胞术检测CD19-CAR T细胞的转染效率。(3)流式细胞术检测CB T细胞和CB CD19-CAR T细胞的CD4、CD8、TCR-α和TCR-γ阳性T细胞的比例以及免疫表型。(4)RNA-seq检测CB T细胞和CB CD19-CAR T细胞的基因表达差异。2、CB CD19-CAR T细胞在DLBCL异体移植模型中的抗肿瘤效应(1)使用细胞渗透性染料Carboxyfluorescein diacetate succinimidylester(CFSE)标记靶向的肿瘤细胞。(2)CB CD19-CAR T细胞与CFSE标记的ALL细胞株(BV173)、K562细胞按照1:1、2:1、5:1和10:1的效靶比共培养24 h,使用流式细胞术检测肿瘤细胞的细胞存活/死亡染料Fixable Viability Stain(FVS)阳性百分率。(3)CB CD19-CAR T细胞与CFSE标记的DLBCL细胞株(SUDHL-4、DB)细胞按照1:1、2:1、5:1和10:1的效靶比共培养24 h,使用流式细胞术检测肿瘤细胞的FVS阳性百分率。(4)CB CD19-CAR T细胞与BV173、SUDHL-4细胞按照1:1的效靶比共培养24h。使用Cytometric Bead Array(CBA)多因子检测技术通过流式细胞术检测共培养后上清中CB CD19-CAR T细胞分泌的Th1/Th2细胞因子水平。3、CB CD19-CAR T细胞对DLBCL小鼠异体移植模型中的肿瘤抑制作用(1)1×106个SUDHL-4细胞与基质胶等体积混合,将混合物通过皮下注射至免疫缺陷BALB/c nude小鼠的背部,一周后观察背部成瘤情况。将成瘤后的小鼠随机分为三组。(2)通过尾静脉注射1×106个CB CD19-CAR T细胞、CB T细胞(正常对照,未经CD19-CAR慢病毒转染)及等体积的PBS(空白对照)。(3)随后每2-3天测量小鼠的背部肿块大小,记录肿瘤进展。同时记录小鼠体重变化,观察小鼠精神状态、皮疹、腹泻、活动状态及食欲等GVHD相关症状。当小鼠肿瘤直径超过20毫米时,实施安乐死。4、检测CB T细胞和CB CD19-CAR T细胞的免疫表型和基因差异(1)CB CD19-CAR T细胞与SUDHL-4细胞按照1:1的效靶比共培养48 h,流式细胞术检测CB CD19-CAR T细胞免疫表型变化,以及免疫检查点蛋白T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3(TIM-3)和Programmed cell death protein 1(PD-1)表达水平。(2)CB CD19-CAR T细胞与SUDHL-4细胞按照1:1的效靶比共培养48 h,使用CD3阳性选择磁珠分选出共培养后的CB CD19-CAR T细胞,与未共培养的CB CD19-CAR T细胞一起送检RNA-seq。分析共培养后CB CD19-CAR T细胞的基因变化。【结果】1.本研究成功构建CD19-CARs慢病毒载体转染CB T细胞。流式细胞术检测转染效率达60.8%。流式细胞术显示CB CD19-CAR T细胞和CB T细胞培养方式一致,在经过培养扩增后没有出现明显的增殖差异。转染后的CB CD19-CAR T细胞与CB T细GW4869临床试验胞在CD4、CD8、TCR-α和TCR-γ等免疫表型上没有显著差异。同时RNA-seq结果显示,与CB T细胞相比,CB CD19-CAR T细胞表现出与细胞膜转运、内吞作用和免疫反应有关的基因变化,这可能是由CARs的组装引起的,与细胞膜的功能增强和T细胞免疫反应相关。2.CB CD19-CAR T细胞靶向CD19+的DLBCL细胞的体外实验结果显示,与CB T细胞相比,CB CD19-CAR T细胞可有效的杀伤CD19+ALL细胞株BV173和DLBCL细胞株SUDHL-4。同时流式细胞术CBA多因子检测结果显示,CB CD19-CAR T细胞在与BV173和SUDHL-4细胞共培养后,相比于CB T细胞分泌更多的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ等细胞因子。CB CD19-CZD1839分子式AR T细胞可以特异性靶向杀伤BV173以及SUDHL-4细胞,并分泌大量细胞因子,但CB CD19-CAR T细胞对SUDHL-4的杀伤作用与效靶比无关。3.CB CD19-CAR T细胞靶向DLBCL异体移植小鼠模型肿瘤的体内实验显示,在DLBCL小鼠异体移植模型中,CB CD19-CAR T细胞有效抑制小鼠体内的DLBCL肿瘤生长,而PBS组和CB T细胞组小鼠肿瘤增长迅速,肿瘤负荷高于CB CD19-CAR T细胞干预组。安全性评价以及GVHD评分表明CB CD19-CAR T细胞治疗过程中未观察到细胞毒性以及GVHD症状。4.CB CD19-CAR T细胞在与肿瘤细胞共培养后显示出CCR-7表型的丧失,由幼稚的T细胞表型转化为终末分化的效应记忆T细胞(Terminal Effector Memory T cells,TEMRA)表型。CB CD19-CAR T细胞在与肿瘤细胞共培养后,免疫检查点蛋白TIM-3的表达出现明显升高,而PD-1表达无明显差异。RNA-seq结果显示CB CD19-CAR T细胞在共培养后出现T细胞衰竭相关基因、共刺激基因以及记忆细胞相关基因的改变。这可能与CB CD19-CAR T细胞抗肿瘤效应后出现衰竭相关。【结论】本课题研究结果表明:1、本研究成功构建CD19-CARs慢病毒载体,可以高效对CB T细胞进行转染。与CB T细胞相比,CB CD19-CAR T细胞无免疫表型的变化,RNA-seq显示细胞膜转运、内吞作用和免疫反应有关的基因变化。2、CB CD19-CAR T细胞可有效杀伤ALL细胞株和DLBCL细胞株,同时能被靶细胞有效激活,分泌大量的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ等细胞因子。其中,CB CD19-CAR T细胞对DLBCL细胞株SUDHL-4的杀伤作用与效靶比无关。3、CB CD19-CAR T细胞有效抑制小鼠体内的DLBCL肿瘤生长。同时安全性评价以及GVHD评分表明CB CD19-CAR T细胞治疗未观察到细胞毒性以及GVHD症状。4、CB CD19-CAR T细胞在与肿瘤细胞共培养后显示出CCR-7表型的丧失,由幼稚的T细胞表型转化为TEMRA表型,此外TIM-3蛋白表达明显升高。RNA-seq结果显示CB CD19-CAR T细胞在共培养后出现T细胞衰竭相关基因、共刺激基因以及记忆细胞相关基因的改变。因此,我们认为CB是通用型CAR T细胞的安全、有效来源,同时CB CD19-CAR T细胞是治疗DLBCL的一种有潜力的治疗策略。CB T细胞的独特生物学特性和高利用性使得通用型CB CAR T细胞疗法具有可行性和普适性。