细胞表面受体(Cell surface receptors)是能感知细胞外信号配体并介导跨膜信号转导以操纵细胞内下游信号,从而影响细胞相关生理和病理状态的一类分子。多种细胞行为,如生长因子信号转导、免疫系统功能、细胞通讯、细胞粘附、细胞迁移和细胞凋亡等都受细胞表面受体聚集的调控。其中,肿瘤细胞表面高表达的核仁素(Nucleolin,NCL)作为典型的受体,参与了许多与细胞增殖、细胞周期和凋亡有关的信号通路,同时也与肿瘤发生、发展过程密切相关,已成为癌症诊断和治疗的重要靶点。通过细胞表面NCL聚集调控细胞凋亡,可以为肿瘤治疗提供一种新的方式,也有望为抗肿瘤药物靶点的研发提供依据。目前,多种策略例如分子纳米技术、磁驱动、聚合物和DNA纳米结构等可用于调控细胞表面受体聚集,从而调节细胞命运。目前受体聚集调控方式大多依赖于外部刺激,如光、热、磁场等,虽然能有效诱导受体聚集,但难以避免对正常组织的损伤。因此,发展新型的受体聚集策略,在有效的杀死肿瘤细胞的同时降低对正常组织的伤害具有非常重要的意义。肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)作为一种区别正常细胞与癌细胞的重要标志,受到临床的重视。肿瘤微环境中的异常因素,如缺氧、高浓度ATP、细胞外低p H和肿瘤相关酶的异常表达,被认为是癌症的特征,在受体聚集中也发挥着重要作用。因而,利用肿瘤微环境原位触发受体聚集有望为靶向治疗提供一种新型有力的手段。金纳米颗粒(Gold nanoparticles,Au ATM/ATR抑制剂NPs)具有稳定性高、易修饰、比表面积大及独特的局域表面等离子体共振(Localized surface plasmon resonance,LSPR)吸收和散射等特点。同时,DNA材料也具有生物相容性好、可编辑性强等优点。为此,本文将能靶向细胞表面NCL的核酸适配体AS1411、特异性响应肿瘤细胞表面高浓度ATP的适配体(aptamer)和微酸性环境的I-strand分别修饰到Au NPs表面,构建了Au NPs-AS1411-apt纳米器件及AI-Au智能纳米器件,用于原位诱导细胞表面NCL受体聚集并触发细胞凋亡。开展的研究内容具体如下:1.基于肿瘤细胞表面高浓度ATP原位诱导NCL聚集调控细胞凋亡本研究利用Au-S键将NCL适配体AS1411和ATP分裂适配体连接到Au NPs上,构建了靶向癌细胞的Au NPs-AS1411-apt纳米器件。利用肿瘤细胞表面高浓度ATP与其分裂适配体的特异性结合,拉近Au Nfungal superinfectionPs颗粒之间的距离,诱导肿瘤细胞表面NCL受体聚集,实现了细胞凋亡调控。LSPR吸收及散射光谱、暗场光散射(Dark field microscopic imaging,DFM)成像等实验结果表明,ATP能有效调控Au NPs-AS1411-apt纳米器件聚集。同时,该器件具有良好的血清稳定性和核酸酶稳定性。更重要的是,细胞毒性实验表明Au NPs-AS1411-apt对正常细胞具有良好的生物相容性,而对乳腺癌细胞(MCF-7)表现出明显的细胞毒性,且伴随着ATP浓度增大,细胞存活率逐渐降低。Calcein-AM/PI活死细胞双染色及细胞核DAPI染色实验表明,随着ATP浓度增大,Au NPs-AS1411-apt纳米器件诱导细胞凋亡效果越来越明显。最后,我们用细胞色素C(Cyt-c)及caspase-3免疫荧光成像探究了Au NPs-AS1411-apt纳米器件诱导细胞凋亡的有关通路,表明线粒体内源性途径参与了细胞表面NCL受体聚集诱导的凋亡过程。2.肿瘤细胞表面微酸性环境原位激活NCL聚集诱导细胞凋亡我们进一步将NCL适配体AS1411和具有酸响应的DNA序列(I-strand)修饰到Au NPs表面,构建了靶向肿瘤细胞表面的AI-Au智能纳米器件。利用肿瘤细胞的微酸性环境触发Au NPs表面的I-strand形成i-Motif结构,使得细胞表面两个或多个相邻的AI-Au智能纳米器件形成交联或聚集状态,从而实现原位诱导NCL受体聚集,并触发肿瘤细胞凋亡。LSPR吸收及散射光谱、水合粒径、扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)等结果显示在溶液p H逐渐降低(7.4,6.5,6.0,5.0)时,AI-Au智能纳米器件聚集程度逐渐增加。DFM成像表明,随着肿瘤细胞表面酸度增加,AI-Au智能纳米器件聚集引起的光散射强度逐渐增加。更重要的是,细胞毒性实验、Calcein-AM/PI活死细胞双染、细胞核染色实验及流式细胞术等结果表明,随着肿瘤细胞表面p H逐渐降低,细胞核逐渐皱缩、细胞体积缩小,活细胞的比例从99.9%降低到51.2%,细胞Mirdametinib试剂凋亡效果显著。Cytc/caspase-3免疫荧光成像进一步证实AI-Au智能纳米器件诱导的细胞凋亡涉及线粒体内源性途径。综上所述,本文在细胞膜上构建了Au NPs-AS1411-apt纳米器件及AI-Au智能纳米器件,靶向结合肿瘤细胞表面NCL,并利用肿瘤细胞表面高浓度ATP及微酸性环境等特有的因素,原位诱导纳米器件聚集,调控细胞表面NCL交联,实现特异性的肿瘤细胞凋亡研究。该策略避免了对正常细胞的损伤、操作简便、通用性强,为探究细胞凋亡机制提供了有力的基础,为新药研发提供了依据,有望成为有前景的肿瘤治疗新手段。