研究目的:程序性死亡受体及其配体(PD-1/PD-L1)是目前研究最广泛的免疫检查点之一,异常PD-1/PD-L1的表达直接影响肿瘤患者免疫治疗疗效,针对PD-1/PD-L1的免疫治疗可显著改善中晚期膀胱癌患者的生存现状。因此,深入探究PD-1/PD-L1表达的具体调控机制对改善膀胱癌患者的临床治疗具有重要的科学意义。肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)是肿瘤赖以生存的必要条件,可从多方面影响包括增殖、侵袭、转移及耐药等的多种肿瘤生物学行为。肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)是TME中的重要组分之一。多项研究提示,CAFs可通过分泌细胞因子募集抑制性免疫细胞或上调肿瘤免疫检disc infection查点的表达以促进肿瘤免疫逃逸,但CAFs对肿瘤细胞PD-L1表达的具体调控机制仍未明确。因此,本研究以CAFs与肿瘤免疫逃逸相关性研究为切入点,深入探究CAFs调控肿瘤细胞PD-L1表达的具体机制,以期寻找能够改善膀胱癌患者治疗现状的新型治疗靶点,为膀胱癌的临床免疫治疗提供新思路。研究方法:通过TCGA和GEO膀胱癌数据库分析CAFs标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activation protein,FAP)的差异性表达与膀胱癌患者预后之间的关联。收集经膀胱癌根治性切除患者的癌与癌旁组织,原代培养CAFs和正常成纤维细胞(Normal fibroblasts,NFs),并采用免疫荧光和Western blot检测α-SMA和FAP的表达,对NFs和CAFs进行鉴定。采用Trans-well小室共培养成纤维细胞和膀胱癌细胞,随后采用细胞划痕实验、Trans-well迁移和侵袭实验、CCK-8细胞活力检测实验及克隆形成实验检测CAFs对膀胱癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响。采用实时荧光定量PCR和Western blot实验检测与CAFs共培养后,膀胱癌细胞糖代谢、谷氨酰胺代谢及PD-L1相关通路信号分子的表达变化;采用western blot检测肿瘤细胞PD-L1及相关信号分子的表达情况,并采用相应抑制剂处理膀胱癌细胞以观察CAFs对膀胱癌细胞PD-L1表达调控的具体机制。将CAFs细胞培养上清液处理24小时的膀胱癌细胞再与人外周血CD8~+T细胞共培养,通过ELISA法检测CD8~+T细胞的IFN-γ分泌能力以评估其免疫活性。结果:我们通过对TCGA和GEO膀胱癌数据库进行分析发现,CAFs标志性蛋白α-SMA和FAP的高表达均与膀胱癌患者预后不良显著相关。免疫荧光和Western blot实验显示,原代培养的NFs和CAFs均表达Vimentin但不表达Pan-keratin;且与NFs相比,CAFs中α-SMA和FAP的表达水平更高,提示成功分离并培养原代NFs和CAFs。采用Trans-well小室共培养成纤维细胞和膀胱癌T24细胞,发Colforsin现与NFs相比CAFs可显著促进T24细胞的迁移、侵袭与增殖能力;与CAFs共培养的T24细胞中糖代谢及谷氨酰胺代谢关键酶的表达均显著上调,提示CAFs可促进膀胱癌细胞代谢重编程。根据本课题组前期研究及相关文献报道,肿瘤糖和谷氨酰胺代谢重编程与PD-L1介导的肿瘤免疫逃逸密切相关,所以我们在TCGA数据库中针对膀胱癌PD-L1与CAFs标志性蛋白的相关性进行了分析,结果显示α-SMA及FAP均与PD-L1的表达呈正相关;此外,体外细胞实验亦证明CAFs能够诱导T24膀胱癌细胞PD-L1表达上获悉更多调。为探究CAFs促进膀胱癌细胞PD-L1表达的具体机制,我们筛选与PD-L1相关通路发现与CAFs共培养后,T24细胞中EGFR及相关下游通路AKT/c-JUN均被显著激活;而联合应用EGFR、AKT、c-JUN抑制剂可削弱CAFs对T24细胞PD-L1的上调作用;此外,CAFs诱导T24细胞上调PD-L1可显著抑制CD8~+T细胞的IFN-γ分泌能力,分别抑制EGFR、AKT、c-JUN的表达可以不同程度地恢复CD8~+T细胞IFN-γ的分泌。上述研究提示膀胱癌细胞PD-L1的上调是削弱CD8~+T细胞对肿瘤杀伤作用的关键,CAFs可以通过激活膀胱癌细胞中EGFR/AKT/c-JUN信号通路上调PD-L1的表达,进而介导肿瘤免疫逃逸。结论:本研究分析发现膀胱癌组织中高CAFs浸润提示患者预后不良,并通过体外实验证明CAFs能够诱导膀胱癌细胞糖代谢和谷氨酰胺代谢重编程并促进膀胱癌进展,进一步深入机制研究发现CAFs通过激活EGFR/AKT/c-JUN信号通路上调膀胱癌细胞PD-L1的表达,抑制CD8~+T细胞的免疫活性进而促进肿瘤免疫逃逸。总而言之,本研究通过聚焦CAFs对膀胱癌细胞PD-L1表达的调控作用,进一步阐释了肿瘤微环境中CAFs促进膀胱癌免疫逃逸的具体机制,从而为探寻膀胱癌治疗新靶点提供必要的理论依据。