研究目的:本研究旨在筛选对抗生素所致肠道菌群失调小鼠有治疗作用的中药及其有效成分,利用16S r DNA高通量测序、非靶向代谢组学等方法揭示中药及其有效成分对抗生素所致肠道菌群失调的影响,探究中药有效成分调节抗生素所致肠道菌群失调的作用机制。研究方法:1.抗生素所致肠道菌群失调动物模型建立采用6周龄(20±2 g)的雄性Balb/c品系SPF级小鼠,随机分为空白对照组(CON)和抗生素相关性腹泻模型组(AAD),AAD组给予盐酸林可霉素(3g/kg),2次/d,0.2 ml/次,灌胃7 d,CON组小鼠灌胃等体积的生理盐水。通过观察小鼠一般情况、粪便性状、结肠组织HE染色、16S r DNA高通量测序分析,综合评价模型成功与否。2.筛选有效调节抗生素所致肠道菌群失调的中药及其有效成分采用6周龄(20±2 g)的雄性Balb/c品系SPF级小鼠,随机分为对照(CON)组、AAD组、菊粉(INU)组、肉苁蓉(RCR)组、乌梅(WM)组、肉苁蓉多糖(RCRDT)组、肉苁蓉松果菊苷(ECH)组,每组8只,连续7 d灌胃盐酸林可霉素(3 g/kg)建立抗生素相关性腹泻模型,CON组小鼠灌胃生理盐水。随后灌胃INU(5 g/kg)、RCR(5 g/kg)、WM(5 g/kg)、RCRDT(200 mg/kg)和ECH(60mg/kg),1次/d,0.2 ml/次,治疗7 d,CON组和AAD组小鼠灌胃等体积的生理盐水。通过观察小鼠一般体征、结肠HE染色、16S r DNA高通量测序分析,综合评价乌梅、肉苁蓉及其有效成分肉苁蓉多糖和松果菊苷对抗生素所致小鼠肠道菌群失调的作用。3.探究松果菊苷调节抗生素所致肠道菌群失调的作用机制采用6周龄(20±2 g)的雄性Balb/c品系selleck产品SPF级小鼠,随机分为对照(CON)组、AAD组、菊粉(INU)组、低剂量松果菊苷(LECH)组、中剂量松果菊苷(MECH)组、高剂量松果菊苷(HECH)组,每组8只,连续7 d灌胃盐酸林可霉素(3 g/kg)建立抗生素相关性腹泻模型,CON组小鼠灌胃生理盐水。随后灌胃INU(5Medical utilization g/kg)、LECH(30 mg/kg)、MECH(60 mg/kg)和HECH(90 mg/kg),1次/d,0.2 ml/次,治疗7 d,CON组和AAD组小鼠灌胃等体积的生理盐水。通过小鼠一般体征观察腹泻症状、结肠HE染色评价肠黏膜组织病理学、使用ELISA法检测小鼠血清IL-6、TNF-α和IL-10的水平、Western blot法检测小鼠结肠ZO-1蛋白和MUC2蛋白表达、16S r DNA高通量测序检测小鼠肠道菌群、非靶向代谢组学分析代谢通路,综合探究松果菊苷调节抗生素所致小鼠肠道菌群失调的作用机制。研究结果:1.抗生素所致肠道菌群失调动物模型建立。与CON组相比,AAD组小鼠体质量减轻,排便次数及排便量明显增加,粪便含水量增加,盲肠充血肿大,全部出现腹泻症状,且结肠组织出现明显炎性改变,肠道菌群丰度和多样性明显降低,Muribaculaceae、拟杆菌、Lachnospiraceae＿NK4A136＿group、Alistipes、乳酸杆菌等益生菌含量减少,大肠埃希氏菌-志贺氏菌、变形杆菌、肠球菌等机会致病菌含量增加(p<0.05)。2.肉苁蓉及其有效成分可以有效调节AAD小鼠肠道菌群失调,改善小鼠腹泻症状。与AAD组相比,RCR组和WM组小鼠体质量恢复,腹泻症状改善,小鼠肠道菌群结构得到调整:厚壁菌门和脱硫杆菌门含量明显减少(p<0.01),Parasutterella菌属含量增加,而Proteus菌属含量减少(p<0.01)。此外,RCR组结肠病理基本恢复至正常水平Belumosudil核磁,α多样性表明RCR组小鼠肠道菌群丰度和多样性较WM组较好,LEf Se分析表明RCR组小鼠肠道菌群结构较WM组得到良性调整,肠道Parasutterella、链球菌属(Streptococcus)、Bacillus、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Faecalibacterium等含量增加(p<0.01)。与AAD组相比,RCRDT组和ECH组小鼠体重恢复,腹泻症状明显改善;ECH组小鼠结肠病理恢复至正常水平;RCRDT组和ECH组小鼠肠道厚壁菌门含量明显减少,Blautia和Lachnoclostridium含量增加,Clostridium＿sensu＿stricto＿1含量减少(p<0.05),此外,ECH组小鼠肠道菌群丰度和多样性较RCRDT组恢复至正常水平,肠道菌群结构得到良性调整,拟杆菌属、Flavonifractor、Agathobacter、Lachnoclostridium、Prevotella-9等含量增加(p<0.01)。3.肉苁蓉松果菊苷有效调节AAD小鼠肠道炎症和菌群失调。与AAD组相比,INU组、LECH组、MECH组和HECH组小鼠体重恢复,腹泻症状明显改善;HECH组小鼠结肠病理恢复至正常水平(p<0.05),且HECH可以使AAD小鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α减少,抗炎因子IL-10含量增加,小鼠结肠MUC-2蛋白、ZO-1蛋白明显增加(p<0.05),说明松果菊苷可以调节AAD小鼠的血清炎症因子,缓解AAD小鼠肠道炎症反应,保护AAD小鼠肠道屏障功能,降低肠道通透性,其中高剂量松果菊苷作用较好。此外,HECH治疗后AAD小鼠肠道菌群丰度和多样性均有所恢复。肠道菌群结构得到良性调整,乳酸杆菌、双歧杆菌、副拟杆菌、Prevotella等益生菌含量增加(p<0.01)。非靶向代谢组学结果表明,松果菊苷治疗后,增加了短链脂肪酸(丙酸、丁酸、异丁酸)含量,与脂肪酸代谢、维生素B6代谢、酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢通路相关(p<0.05)。研究结论:1.肉苁蓉和乌梅均可以调节抗生素所致肠道菌群失调,改善AAD症状,肉苁蓉的作用较明显。2.肉苁蓉及其有效成分肉苁蓉多糖和松果菊苷均可调节AAD小鼠肠道微生物群,对肠道内的有益菌和致病菌进行良性调整,恢复肠道菌群失调,改善小鼠腹泻症状;其中松果菊苷的作用更明显。3.肉苁蓉松果菊苷一方面通过增加肠道菌群代谢物短链脂肪酸的含量,保护肠道屏障,降低肠道通透性,改善肠道炎性反应,以缓解小鼠腹泻症状;另一方面通过对肠道内的有益菌和致病菌进行良性调整,防止细菌移位并修复肠黏膜屏障,进而调节肠道微生态。