目的:通过模拟缺氧环境体外培养小鼠精原干细胞C18-4研究其自我更新能力及铁代谢相关蛋白表达情况的改变方法:本课题组首先通过单细胞测序方法,绘制人及小鼠睾丸组织中HIF-α及铁代谢蛋白时空表达谱系。然后通过构建体外培养的小鼠精原干细胞(C18-4细胞系)模型模拟缺氧环境,应用CCK-8法及EdU法检测缺氧对小鼠精原干细胞增殖能力的影响,并采用免疫印迹法,检测HIF-1α蛋白和铁代谢相关蛋白在细胞中表达的改变。同时应用qPCR方法检测铁死亡相关蛋白的mRNA表达情况。本实验拟阐明缺氧对精原干细胞C18-4自我更新的影响及铁代谢蛋白表达情况的改变,并探讨其可能的机制。结果:1.常氧条件下C18-4在显微镜下呈圆形或卵圆形,附着在培养皿上生长并增殖形成集落,另外随培养时间的增加,所观察到SSCs集落的数量及各集落SSCs的数量也随之增加。2.在模拟缺氧条件下C18-4细胞集落数目和每个集落中的细胞数目降低,并且随着体外缺氧培养时间的增加,selleck细胞集落的数目同对照组相比明显减少,密度逐渐下降;并且随着氯化钴(CoCl2)的药物浓度逐渐增加,细胞集落的数量逐渐减少,密度逐渐下降,形态逐渐变得不规则。3.CoCl2模拟缺氧条件下培养的C18-4细胞在0h、24 h、48 h、72 h四个不同时间点应用CCK-8法检测细胞增殖能变化,随着作用时间增加,细胞增殖能力逐渐减弱。4.分别用CoCl2浓度50.0、100.0、150.0、200.0μmol/LCoCl2处理 C18-4 细胞 24h 培养Z-IETD-FMK生产商后进行检测,随着 CoCl2浓度的增加,细胞增殖能力逐渐降低(P<0.001)。5.CoCl2处理C18-4细胞进行体外培养48h后,EdU结果显示缺氧组C18-4细胞较对照组C18-4细胞的体外增殖能力明显下降。6.用200 μmol/L CoCl2处理C18-4细胞分别培养24h、48 h、72h,用免疫印迹法观察HIF-1α蛋白表达变化。与对照组相比,缺氧组在24h、72h检测HIF-1α蛋白表达水平相对增加,且差异具有统计学意义(P<0.05);用200μmol/L CoCl2处理C18-4细胞72h时,与对照组相比,缺氧组中HIF-1α蛋白的表达水平显著增加,并且差异有高度统计学意义(P<0.0001)。7.分别用50、100、150、200 μmol/L CoCl2处理C18-4细胞24h,用免疫印迹法观察HIF-1α蛋白表达变化。与对照组相比,缺氧组(100、150μmol/L CoCl2处理组)HIF-1α蛋白表达水平相对增加,且差异具有统计学意义(P<0.01);用200μmol/LCoCl2处理C18-4细胞24h时,与对照组相比,缺氧组中HIF-1α蛋白的表达水平显著增加,且差异有统计学意义(P<0.001)。8.用200 μmol/LCoCl2处理C18-4细胞24小时,缺氧组FPN蛋白表达水平较对照组明显下降,且差异具有统计学意义(P<0.05),但FTH、FTL蛋白表达水平与对照组相比明显增加,且差异具有统计学意义(P<0.05)。9.用荧光定量PCR检测两组细胞中的GPX4、Acsl4、Sat-1、DJ-1并计算其相对表达量,与对照组相比,GPX4、Acsl4 mRNA水平未发生明显变化(P>0.05),Sat-1 mRNA水平升高,且具有统计学意义(P<0.001),DJ-1 mRNA水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。10.通过检测C18-4细胞内MDA的含量可以反映脂质过氧化水平,与对照组相比,低氧组MDA含量显著增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。11.应用抗氧化剂,铁死亡抑制剂处理模拟缺氧条件下培养的C18-4细胞系,经24h培养后,NAC实验组细胞数量较缺氧对照组(200μmol氯化钴处理24h)明显增多、密度上升。而Uridine实验Immunohistochemistry组、Fer-1实验组细胞数量、密度无明显变化。结论:缺氧条件下体外培养C18-4细胞自我更新能力下降,且C18-4细胞缺氧诱导因子1α蛋白表达水平上升。缺氧条件下体外培养C18-4细胞内缺氧诱导因子的下游调控分子铁代谢相关蛋白发生变化,提示精原干细胞内铁稳态失衡并导致脂质过氧化物的大量积累,这可能是缺氧诱导因子对精原干细胞自我更新能力调节的一种分子机制。本研究为进一步研究男性不育的病因提供了新的理论基础并为进一步探索精原干细胞自我更新的分子机制提供了新的实验依据。