绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一类存在于海洋腔肠动物体内的生物发光蛋白,其对细胞和组织毒副作用小,且易于检测,被广泛应用于生命科学研究等领域。但GFP在应用过程中具有一定的局限性,如酸性环境、组织样本的冷冻保存、组织学制剂和固定剂的使用会导致GFP荧光完全或部分丧失。单域抗体(Single-domain antibody,sdAb)作为理想工具可解决这一问题。鲨源单域抗体,即鲨源新抗原受体可变区(Variable domain of immunoglobulin new antigen receptor,VNAR),是目前已知的最小抗原结合单位,其固有的分子量小、结构简单、亲和力高、稳定性强以及自身免疫原性低等优点使其成为研究热点。因此,靶向GFP的鲨源单域抗体将具备广泛的应用前景与商业价值。本文以重组的绿色荧光蛋白突变体(Enhanced consensus green protein variant 123,eCGP123)作为抗原免疫条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum),在第三次和第四次免疫结束后采集外周血并分离白细胞,构建了大小分别为3.4×10~8 CFU和3.9×10~8 CFU的抗体文库。利用噬菌体展示技术对抗体文库进行三轮生物MEK抑制剂淘选,最终筛选到36条不同的VNAR序列,命名为aGFP-1至aGFP-36。将36条VNAR序列分别构建至pTT5-TEV-Fc真核表达载体,转染HEK JQ1293F细胞,表达并纯化得到重组抗体。差式扫描荧光测定结果显示重组抗体的熔解温度(Melting temperature,T_m)介于50～65℃之间。通过生物膜干涉技术测定抗原-抗体平衡解离常数(Dissociation equilibrium constant,K_D),结果显示36个抗体对eCGP123均具有较高的亲和力,K_D值介于6.76～605 nM之间。其中,aGFP-14和aGFP-15的亲和力达到纳摩尔级别,K_D值分别为6.76 nM和8.92 nM,且两者识别eCGP123蛋白上genetic stability的同一表位。利用尺寸排阻色谱法和免疫共沉淀技术验证了抗体aGFP-14或aGFP-15可与eCGP123特异性结合并形成稳定复合物。为阐明aGFP-14与eCGP123的结合方式和相互作用位点,利用X射线衍射技术解析得到eCGP123-aGFP-14复合物的晶体结构,结果显示两者之间的作用力主要为结合界面氨基酸之间的氢键相互作用。增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)是另一种绿色荧光蛋白突变体,常作为荧光示踪剂应用于显微成像研究。免疫荧光实验结果显示,aGFP-14能够特异性识别Hela细胞、HEK 293T细胞和小鼠脑组织中表达的EGFP蛋白。本研究结果为GFP鲨源单域抗体应用于显微成像、亚细胞定位、蛋白靶向降解和疾病诊断等领域提供理论参考。