细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)酶是一gibberellin biosynthesis类以血红素为辅基的单加氧酶,广泛参与生物体中内源性底物和外源性药物的氧化代谢,其代谢途径包括羟基化、去甲基化以及环氧化等。CYP4家族是人类第二大CYP家族。其中,细胞色素P450 4F2(CYP4F2)是一种ω-羟化酶,其功能包括催化花生四烯酸生成20-羟二十烷四烯酸,分解代谢白三烯B4和长链脂肪酸以及启动维生素K和维生素E的代谢等。α-生育酚(α-TOH)是维生素E中生物活性和生物利用率最高的抗氧化剂,它是CYP4F2的主要底物之一。阐明CYP4F2与α-TOH的结合机制有利于我们了解α-TOH的代谢过程,丰富CYP4F2的结构-功能关系,为基于底物的药物设计提供理论指导。本论文利用同源模建方法构建了CYP4F2的蛋白结构,通过分子对接方法获得了α-TOH与CYP4F2的复合物模型,并采用分子动力学模拟结合多种分析方法研究了α-TOH与CYP4F2的相互作用过程以及重要残基突变对二者结合的影响。具体内容包括:1.细胞色素P450 4F2与α-生育酚相互作用的分子动力学模拟研究α-生育酚(α-TOH)是一种强效的抗氧化剂。在维生素E的八种形式(α-、β-、γ-和δ-生育酚和α-、β-、γ-和δ-生育三烯酚)中,α-TOH具有最高的生物活性和生物利用率。血浆中α-TOH的浓度与人体健康密切相关,浓度较低可能会导致人体生长发育迟缓、贫血和免疫下降;浓度过高可能会导致许多不良反应。CYP4F2是人体中主要代谢α-TOHselleck的细胞色素P450酶,它通过对α-TOH的末端甲基进行ω-羟基化来激活α-TOH的代谢。阐明α-TOH与CYP4F2的结合机制,揭示α-TOH与CYP4F2的相互作用细节对了解α-TOH的代谢过程具有重要意义。目前,CYP4F2的蛋白结构尚未被解析。在本章工作中,我们通过同源模建和分子对接构建了α-TOH-CYP4F2复合物的模型,综合利用分子动力学模拟和结合自由能分析等计算方法对复合物体系进行研究以明确α-TOH与CYP4F2结合的关键因素及二者的相互作用细节。结合自由能计算及自由能面图分析结果表明,疏水作用和氢键作用是α-TOH与CYP4F2结合的关键因素。8个关键残基(V67、V76、F124、V395、P396、V397、L421和L504)在CYP4F2的活性位点形成疏水空腔稳定α-TOH与CYP4F2的结合,S423与α-TOH形成唯一的氢键将α-TOH锚定在有利于发生ω-羟基化的位置。该项工作丰富了CYP4F2的结构信息,有利于我们理解α-TOH与CYP4F2的相互作用过程,为研究CYP4F2介导的其它底物的ω-羟基化提供了有益的理论参考。2.细胞色素P450 4F2重要残基突变对α-生育酚结合的影响基于前一部分的计算结果,并结合相关实验数据和CYP4F2的结构特征,我们推测S423、V433和E328可能对α-TOH与CYP4F2的结合有重要作用。前一部分的研究发现S423与α-TOH形成唯一的氢键,S423可能对α-TOH与CYP4F2的结合至关重要。有报道称V433M突变会显著降低CYP4F2对α-TOH的ω-羟基化活性。我们观察到,V433的位置远离CYP4F2的活性位点,远端残基V433突变如何影响CYP4F2的结构特征和底物结合引起了我们的研究兴趣。此外,CYP4家族酶I螺旋上的谷氨酸与血红素形成酯键,这此网站使得该家族酶能够选择性催化底物发生ω-羟基化。CYP4F2中I螺旋上的E328与血红素形成酯键,该酯键对α-TOH发生羟基化的影响尚不明确。为了研究S423、V433和E328对α-TOH与CYP4F2结合的影响,我们设计突变实验对S423A,V433M和E328A突变型体系分别进行了分子动力学模拟。结果表明,S423与α-TOH之间氢键的消失导致α-TOH发生位移,减弱了α-TOH与CYP4F2的相互作用,破坏了发生ω-羟基化反应的距离条件。V433通过远端调控影响α-TOH与CYP4F2的结合,V433M突变引起蛋白构象变化,破坏了原有的疏水空腔和S423与α-TOH之间的氢键,不利于α-TOH与CYP4F2的结合。E328与血红素之间的酯键将α-TOH限制在一个狭窄的空腔内,有利于α-TOH在ω位点发生羟基化反应;在E328A突变型体系中,酯键的消失增加了ω-1位点的碳原子与血红素接触的概率,从而增加了α-TOH的ω-1位点发生羟基化反应的可能性,减弱了CYP4F2对α-TOH发生ω-羟基化的选择性。S423A、V433M和E328A突变直接或间接地改变了α-TOH与CYP4F2的结合模式,降低了二者的结合亲和力,不利于α-TOH发生ω-羟基化。该项工作在原子水平上阐明了重要残基突变对α-TOH与CYP4F2结合的影响,有利于我们更好的理解CYP4F2的结构-功能关系。