目的1 评价祛湿通络方联合阿奇霉素治疗儿童肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)的有效性与安全性,探索其在因MPP导致的微循环障碍“肺络瘀血”中的调节作用。2 研究肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)感染人呼吸道上皮细胞(Beas-2b)上清液及细胞中炎症因子水平的影响及祛湿通络方对PI3K/AKT信号通路调节作用。3 初步探索祛湿通络方治疗MP感染小鼠的作用机制。方法1 第一部分:祛湿通络方联合阿奇霉素治疗MPP的临床疗效评价。临床试验:收集来自2021年02月至2022年12月之间的辽宁中医药大学附属医院与河南中医药大学第一附属医院的共96名确诊患儿。按照2:1的比例随机分组(治疗组64例、对照组32例),治疗组给予口服祛湿通络方配方颗粒联合静脉滴注阿奇霉素,对照组在静脉滴注阿奇霉素的基础上口服祛湿通络方配方模拟剂,治疗疗程为5天。治疗结束后分析主要疗效指标(疾病的总有效率、中医证候疗效)、次要疗效指标(完全退热时间、退热起效时间、咳嗽、咳痰、气喘起效时间)及凝血四项(凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)),并对本方的安全性及有效性进行评估。2 第二部分:祛湿通络方干预MP诱导的Beas-2b细胞的作用细胞实验:实验前期进行祛湿通络方有效活性成份鉴定、祛湿通络方与阿奇霉素干预浓度筛选等工作。将Beas-2b细胞分为7组,分别为空白组、模型组、中药组3个组(低、中、高剂量组)、阿奇霉素组、联合用药组(中药中剂量+阿奇霉素),造模干预结束后观察细胞形态改变,并收集细胞上清液与细胞。细胞上清液用于ELISA法检测炎症因子白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)水平,收集细胞并提取RNA用于实时荧光定量PCR法检测IL-6、IL-1β基因表达情况。3 第三部分:祛湿通络方对MP感染的BALB/c小鼠模型的作用机制3.1 祛湿通络方对MP感染的BALB/c小鼠模型的作用分组方法:将雌性BALB/c小鼠72只随机分为9组,每组8只,分别为空白组3组(第3天,简称K3组;第7天,简称K7组;第14天,简称K14组)、模型组3组(第3天,简称M3组;第7天,简称M7组;第14天,简称M14组)、联合用药组3组(阿奇霉素+祛湿通络方,第3天,简称L3组;第7天,简称L7组;第14天,简称L14组)。干预方法:MP造模3天后空白组、模型组分别给予生理盐水连续灌胃3天、7天、14天,200μL/天/只,联合用药组灌胃540mg/mL祛湿通络颗粒与9.01mg/mL阿奇霉素3天、7天、14天,200μL/天/只。观察指标:干预期间记录小鼠体重、进食量与行为学变化,如果出现小鼠精神萎靡、活动减少、竖毛无光泽、进食饮水量减少、呼吸频率加快、体重减少等情况则视为模型建立成功。干预结束后收集肺组织进行HE染色、免疫组化、Western blot实验。3.2 祛湿通络方对MP感染的急性期BALB/c小鼠模型的作用机制研究分组方法:将雄性BALB/c小鼠72只随机分为8组,每组9只,分别为空白组、模型组、中药组(低、中、高剂量)、阿奇霉素组、联合用药组(中药中剂量+阿奇霉素)、抑制剂组。干预方法:MP造模3天后,所有组别连续灌胃3天,灌胃量200μL/次/只。其中,空白组与模型组,灌胃生理盐水;中药组,灌胃浓度分别为270mg/mL、540mg/mL、1080mg/mL;阿奇霉素组,灌胃浓度9.01mg/mL;联合用药组,灌胃中药中剂量与阿奇霉素;抑制剂组,静脉注射LY294002通路抑制剂,同时灌胃中药中剂量。观察指标:干预期间记录小鼠体重、进食量与行为学变化,干预结束后收集肺组织进行HE染色、免疫组化检测、Western blot实验,收集血浆检验活化部分凝血活酶时间(APTT)与凝血酶原时间(PT)。结果1.临床研究1.1 主要疗效指标对治疗组与对照组的疾病总有效率进行统计比较,差异有统计学意义(P=0.041<0.05),治疗组总有效率优于对照组。对两组的中医证候疗效进行统计比较,差异有统计学意义(P=0.039<0.05),治疗组的中医证候疗效优于对照组。1.2 次要疗效指标将两组的完全退热时间、退热、咳嗽、咳痰、气喘起效时间进行比较,完全退热时间(P=0.041<0.05)、退热起效时间(P=0.035<0.05)、咳嗽起效时间(P=0.030<0.05)、咳痰起效时间(P=0.048<0.05)、气喘起效时间(P=0.041<0.05),差异均具有统计学意义,治疗组完全退热时间、退热、咳嗽、咳痰、气喘起效时间少于对照组。1.3 凝血四项比较对治疗前后两组患儿PT、APTT、FIB、T-T水平进行比较,两组在治疗前PT、APTT、FIB、T-T水平差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。治疗后两组患儿PT、APTT、FIB、T-T水平差异仍无统计学意义(P>0.05),说明两组治疗后PT、APTT、FIB、T-T水平亦无明显差异。分别比较两组治疗前后PT、APTT、FIB、T-T水平的差异,均有统计学意义(P<0.05),说明两组患儿在治疗后PT、APTT水平均有明显升高,FIB、T-T水平在治疗后均有显著下降。对两组PT、APTT升高程度及FIB、T-T下降程度进行比较,P>0.05,提示治疗组与对照组在提高PT、APTT水平和降低FIB、T-T水平方面无统计学意义,说明祛湿通络方联合阿奇霉素与单独使用阿奇霉素均可提高PT、APTT水平,降低FIB、T-T水平。2.细胞实验研究2.1 祛湿通络方成份鉴定发现有效活性成份主要包柚皮苷(Naringin)、白藜芦醇(Resveratrol)、槲皮素(Quercetin)、白杨素(Chrysin)、山奈酚(Kaempferol)、香兰素(Vanillin)、异鼠李素(Isorhamnetin)、芦丁(Rutin)、6-O-甲基黄芩苷(6-O-Methylscutellarin)、木犀草素(Luteolin)、黄芩素(Wogonin)、芒柄花素(Formononetin)等。2.2 药物干预浓度筛选对祛湿通络方与阿奇霉素分别进行浓度筛选,最终选用祛湿通络方600ug/mL、300ug/mL、150ug/mL,阿奇霉素7.8ug/mL为本实验的药物干预浓度。2.3 细胞形态观察给药组与模型组进行对比,模型组出现大量漂浮死细胞,贴壁细胞约30%,细胞变形,挛缩,细胞核破裂,出现大量细胞碎片,给药组细胞形态基本正常,细胞贴壁50%以上,散在细胞碎片。说明祛湿通络方、阿奇霉素及联合用药组在细胞形态层面上有保护Beas-2b细胞的作用。2.4 Elisa法检测细胞上清液IL-6、TNF-α、IL-1β水平除中药低剂量组外(IL-6:P=0.7879,TNF-α:P=0.9886),中药中、高剂量组、阿奇霉素组与联合用药组均可降低细胞上清液中的IL-6、TNF-α水平(P<0.05);中药低、中、高剂量组、阿奇霉素组及联合用药组对细胞上清液中的IL-1β水平有降低作用,均有统计学差异(P<0.05)。此外还发现祛湿通络方联合阿奇霉素降低细胞上清液IL-6、TNF-α、IL-1β水平较单独用药效果更佳(P<0.05)。2.5 荧光定量PCR法检测细胞中IL-6、IL-1β基因表达情况中药低、中、高剂量组、阿奇霉素组及联合用药组对IL-6、IL-1β基因表达具有明显下调作用(P<0.0001),说明各组药物对MP感染后的Beas-2b细胞均有抗炎作用;联合用药组与单独用药组差异明显(P<0.05),说明中西医联合用药具有协同增效作用。3.动物实验研究3.1 祛湿通络方对MP感染的BALB/c小鼠模型的作用3.1.1 体重与进食量(1)空白组体重逐渐上升,并在16～17g左右稳定,其他六组小鼠在造模后第二天出现体重下降,模型组下降速度大于联合用药组。(2)M14、L14两组在8～10天时(给药后的5到7天)出现体重的回升,但模型组体重回升时间较联合用药组时间稍后,上升速度较慢,且体重变化易反复。(3)空白组三组小鼠,进食量稳定波动在14～16g之间。模型组与联合用药组在造模的第二天出现进食量骤然下降,并在第8天开始上升。M14与L14组相比,进食量在12天后趋于一致。3.1.2 行为学变化(1)空白组三组小鼠精神状态良好,毛发正常有光泽,活动良好,无呼吸急促,口鼻周无分泌物,大便正常。(2)模型组三组在造模第二天出现精神状态欠佳,嗜睡,而后逐渐萎靡,反应迟钝,活动量减少,竖毛无光泽,寒战,呼吸频率增快,口鼻周围出现分泌物,大便质粘,气味较空白组臭。(3)联合用药组造模第二天出现精神欠佳,嗜睡,竖毛无光泽,寒战,呼吸频率增快,口鼻周围出现分泌物,在给药第二天上述症状开始好转,但较空白组差,L14组在给药第7天精神状态好转,无嗜睡,毛发正常无竖毛,无寒战,给药第13天时上述症状完全好转,但体重较空白组低。3.1.3 肺组织病理学观察(1)K3与K7组肺泡结构清晰,上皮细胞排列整齐,各级支气管厚度一致,肺泡内无明显分泌物,气管周围未见明显巨噬细胞、嗜酸性粒细胞浸润;K14组肺泡间隔轻度增厚,上皮细胞轻度增生,管腔内未见明显分泌物,血管少量出血。(2)模型组三组较空白组,出现肺实变,肺泡消失,大量炎性细胞与嗜酸性粒细胞浸润,上皮细胞增生严重,M3组肺泡周围的炎性渗出较M7组严重,M3组出现大量血管出血,M14组较M3组与M7组相比炎性细胞减少,但气道上皮仍然增生。组织病变程度排序M3组>M7组>M14组。(3)联合用药组和模型组相比,未见明显大片肺实变,气道炎性细胞与嗜酸粒细胞明显减少,上皮细胞增生减轻,L7组与L3组相比,肺泡腔融合程度减轻,L14组与L3组、L7组比较肺泡结构较清晰。3.1.4 免疫组化检测IL-6、TNF-α(1)空白组与模型组相比,差Raf抑制剂异有统计学意义(P<0.0001),模型组小鼠肺组织中IL-6显著增高;药物干预后,IL-6水平给药组较模型组明显下降(M3 vs L3P=0.001<0.05,M7vs L7P=0.0287<0.05,M14vs L14P=0.0215<0.05)。(2)在MP感染后小鼠肺组织中的TNF-α显著增高,差异有统计学意义(P<0.0001),药物干预后,模型组与联合用药组相比,TNF-α显著降低(M3 vs L3 P=0.001<0.05,M7 vs L7 P=0.0018<0.05,M14vs L14P=0.0085<0.05)。3.1.5 Western blot 测定 PI3K/AKT 通路蛋白PI3K/AKT通路蛋白在各组间表达有明显差异,造模后模型组与空白组相比,p-PI3K/PI3K蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.0001),p-AKT/AKT蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(K3vs M3 P=0.0021<0.05,K7vs M7P<0.0001,K14vs M14 P=0.0063<0.05)。药物干预后,PI3K/AKT通路蛋白显著上升,联合组与模型组相比差异有统计学意义(M3 vs LNASH non-alcoholic steatohepatitis3 P= 0.0002<0.05,M7 vs L7 P=0.0002<0.05,M14 vs L14 P=0.0037<0.05),提示MP感染后可抑制PI3K/AKT通路的表达,祛湿通络方联合阿奇霉素可激活PI3K/AKT信号通路以达到治疗作用。3.2 祛湿通络方对MP感染的急性期BALB/c小鼠模型的作用机制研究3.2.1 体重与进食量(1)空白组体重平稳上升,达到19g左右时保持稳定;其余组在造模后体重缓慢上升,模型组上升速度最低,造模第二天后体重均降低。(2)空白组进食量保持稳定,均在30g左右,造模后除空白组外其余组进食量均下降,给药组在第三天时进食量有所恢复,模型组的平均进食量低于其他各组。3.2.2 行为学变化(1)空白组小鼠精神状态未见明显异常,毛发顺滑有光泽,活动灵活,未见呼吸急促、咳嗽,口鼻周围无异常分泌物,大便正常。(2)模型组与空白组对比,造模第二日开始出现精神状态欠佳,嗜睡萎靡,呼吸频率增快,咳嗽,竖毛无光泽,寒战,口鼻周分泌物,大便粘滞。(3)中药低、中、高剂量、阿奇霉素、联合用药组在造模第二日出现模型组上述症状,但程度介于模型组与空白组之间。3.2.3 肺组织病理学观察(1)空白组、模型组与3.1.3节中空白组、模型组相应肺组织结构类似。(2)中药低剂量组可见肺组织实变,肺泡融合成肺大泡,肺泡周围有炎性细胞和嗜酸性粒细胞渗出,但较模型组浸润程度低;中药中剂量组可见大范围肺组织实变,上皮细胞大量增生,中性粒细胞浸润较低剂量组程度低;中药高剂量组、阿奇霉素组与联合用药组肺组织实变程度低,可见上皮细胞轻度增生,血管内少量出血。(3)抑制剂组肺组织轻度实变,上皮细胞增生,肺泡周围可见炎症细胞和嗜酸性粒细胞浸润,血管内大量出血。3.2.4 免疫组化与WesteFUT-175rn blot检测(1)模型组较空白组VEGFA水平明显下降(P<0.05);治疗后药物干预各组较模型组比较,VEGFA水平差异具有统计学意义(P均<0.05),低剂量组、中剂量组、高剂量组、阿奇霉素组、联合用药组VEGFA水平均显著上升;应用PI3K通路抑制剂后,抑制剂组与中剂量组比较VEGFA水平下降(P<0.05)。(2)模型组较空白组LC3B水平明显升高(P<0.0001);治疗后药物干预各组与模型组比较,LC3B水平差异具有统计学意义(P<0.0001),用药各组LC3B水平显著下降;抑制剂组与中剂量组比较(P<0.05),LC3B水平显著升高。(3)空白组与模型组比较,Beclin1差异无统计学意义(P=0.8093>0.05);各给药组与模型组相比,Beclin1比较无明显差异(P均>0.05),提示Beclin1在本实验中MP感染小鼠及药物治疗后均无明显差异,猜测与本实验肺组织对Beclin1因子不敏感有关,有待后续实验验证。(4)PI3K/AKT通路在本实验第二部分第一节中发现有明显变化,本节在MPP急性期时进行PI3K/AKT通路抑制剂回复实验,以验证祛湿通络方联合阿奇霉素治疗MPP与本通路相关。空白组与模型组相比p-PI3K/PI3K蛋白与p-AKT/AKT蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.0001);各组药物干预后与模型组比较,p-PI3K/PI3K蛋白与p-AKT/AKT蛋白差异有统计学意义(P均<0.05),提示药物干预后PI3K/AKT通路被激活;应用PI3K抑制剂阻断PI3K/AKT通路,发现抑制剂组p-PI3K/PI3K蛋白与p-AKT/AKT蛋白明显下降,差异有统计学意义(P均<0.0001)。3.2.5 PT 与 APTT 比较模型组PT与APTT显著下降(P<0.0001),给药组较模型组PT与APTT升高(P<0.0001),说明MP感染小鼠后PT与APTT下降,机体呈高凝状态,当给药后PT与APTT升高,高凝状态缓解。结论1经RCT临床试验验证,祛湿通络方联合阿奇霉素相比单独应用阿奇霉素治疗MPP,有较高的临床治愈率,可缩短退热时间,降低退热、咳嗽、咳痰、气喘起效时间,减少MP对患儿肺组织的损伤,缓解MP感染引发的机体高凝状态,减少微循环障碍中“肺络瘀血”的发生。2祛湿通络方可调节PI3K/AKT信号通路,激活VEGFA蛋白,抑制自噬,降低IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子,缓解微循环障碍,保护肺组织。