真姬菇学名斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus),是亚洲市场流行的食药两用真菌,具有显著的发展潜力和良好的市场前景。真菌免疫Panobinostat调节蛋白(FIPs)是从真菌中分离出来的一类结构类似免疫球蛋白的生物活性蛋白,具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、促进细胞因子表达等生物活性。发掘新型FIPs并探索其药用价值为利用大型真菌开发营养补充剂和新药提供了新的研究思路。本研究以南方灵芝(Ganoderma ausrenal medullary carcinomatrale)免疫调节蛋白c13717为模板,在实验室测序的真姬菇基因组中进行BLAST比对,发现3个与c13717相似性在50%以上的新型蛋白,将其分别命名为FIP-hma1,FIP-hma2和FIP-hma3。生物信息学分析表明FIP-hmas是由143-147个氨基酸组成的疏水性蛋白质,分子量为14.79-15.43 k Da。N末端区域显示3个蛋白均含有信号肽,亚细胞定位发现蛋白分泌购买S63845于细胞外。FIP-hmas含有Cerato-platain(CP)保守结构域,属于CP类型FIP。系统发育树分析表明,FIP-hmas属于FIPs家族的一个新分支,显示出与其他FIPs较大的进化差异,可能是从不同的祖先进化而来。三维结构预测FIP-hmas含有短α-螺旋,六个β-折叠以及多个无规则卷曲,与保守结构域分析将其归为CP类型FIP的结果相印证。采用实时荧光定量PCR检测三个FIP-hmas基因在真姬菇发育过程中的基因表达水平。结果表明FIP-hma1和FIP-hma2的表达量在营养生长阶段比生殖生长阶段高,尤其是菌丝后熟期。然而FIP-hma3的表达量在营养生长阶段开始和生殖生长阶段结束处于较高水平,即发菌至菌丝长满栽培瓶一半时以及子实体成熟期的表达量高。为了提高产量,进一步构建了表达载体p Smart I-FIP-hmas并转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统进行重组蛋白表达,最终成功表达纯化出FIP-hma2。对重组菌株高效可溶性融合蛋白的表达条件和纯化条件进行筛选,确定最佳表达条件为在15℃,1.0 m M IPTG诱导培养16 h,可获得的可溶性蛋白最多。采用Ni-NTA分离,不同咪唑溶液梯度洗脱后,可收集到纯化蛋白。采用SUMO蛋白酶剪切去除标签,并经SDS-PAGE和Western-blot验证,成功分离得到纯化重组蛋白FIP-hma2(r FIP-hma2)。然后,对r FIP-hma2的体外免疫活性进行研究。Western blot分析表明r FIP-hma2显著提高了RAW 264.7巨噬细胞中i NOS、IL-1β和IL-6的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)表明r FIP-hma2增强了IL-6、TNF-α和IL-1β向细胞外液的释放,表明r FIP-hma2通过激活核心免疫调节因子起到激活免疫应答的作用。综上,本研究在真姬菇中发现3种新型免疫调节蛋白并鉴定了生物信息学特征。在大肠杆菌系统中表达并分离纯化出FIP-hma2,并且优化重组表达和纯化条件,为FIPs的重组生产提供了有效的方法。体外免疫活性试验研究发现r FIP-hma2增加巨噬细胞特定细胞因子的释放,表现出免疫激活调节活性。该研究为FIPs的生理功能研究和产业化应用提供了依据。