目的:基于益肾解毒通络法,以实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)为研究对象,以β-arrestin1为研究靶点,从藏象理论、免疫失衡、神经再生与组蛋白乙酰化的角度来探讨益肾达络饮对EAE的影响与作用机制,以及益肾达络饮通过β-arrestin1对EAE小鼠体内炎性因子、免疫细胞平衡、星形胶质细胞胶质化、表观遗传修饰的影响,以期完善益肾达络饮治疗EAE的机制探索。方法:1.使用文献整合与文献研究的方法,从藏象理论出发,对益肾达络饮治疗多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)的理论基础进行探讨。2.β-抑制蛋白(β-arrestin)1是一类具有多种生物学功能的细胞内支架蛋白,本文采用EAE作为研究MS的动物模型,利用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)为载体,包装β-arrestin1 si RNA腺相关病毒,通过尾静脉注射到小鼠体内抑制体内β-arrestin1的表达。3.将C57BL/6J雌性小鼠分为空白组、模型组、AAV-β(β-arrestin1 si RNA干扰重组腺相关病毒)组、中药组、AAV-β+中药组、西药组。除空白组外均制备EAE模型,每天称量体重,评估神经功能评分。造模第4天,AAV-β组与AAV-β+中药组每只给予尾静脉注射AAV-β150μL(病毒滴度为1×10~(11)vg/m L),用以抑制EAE小鼠体内β-arrestin1的表达。造模第8天,空白组、模型组、AAV-β组给予0.9%氯化钠水溶液灌胃,中药组与AAV-β+中药组予益肾达络饮药液灌胃,西药组予醋酸泼尼松混悬液灌胃,每天1次,共持续灌胃14 d后取材。4.采用苏木精-伊红染色(Hematoxylin and Eosin Staining,HE)与劳克坚牢蓝(Luxol Fast Blue,LFB)髓鞘染色观察EAE小鼠脑组织与脊髓组织的病理形态学改变。5.收集EAE小鼠血液,其中血清用于测量益肾达络饮干预前后EAE小鼠血清中白细胞介素(interleukin,IL)-2、IL-23、IL-27、IL-35、干扰素γ(Interferonγ,IFN-γ)的含量变化,提取血液中的红细胞用于检测EAE小鼠红细胞中腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)含量的变化。6.取EAE小鼠脾脏运用流式细胞术测量脾脏中辅助性T细胞(Helper T cell,Th)17细胞、调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)细胞数量以及Th17/Treg细胞比例的变化。7.取EAE小鼠的脑和脊髓组织,采用Western Blot法分别检测脑与脊髓组织中β-arrestin1、腺苷A1受体(Adenosine A1 receptor,A1AR)、嘌呤能受体(Recombinant Purinergic Receptor P2Y1,P2Y1R)、胶质细胞源性神经营养因子(Glial Cell-Derived Neurotrophic factor,GDNF)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、P53蛋白(P53 protein,P53)、组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)1、组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(Histone H3 lysine residue 9 acetylation,H3K9ac)、组蛋白H4第5位赖氨酸乙酰化(Histone H4 lysine residue 5 acetylation,H4K5ac)的表达量。8.采用免疫组织化学染色法分别检测脑与脊髓组织中β-arrestin1、A1AR、P2Y1的表达量。结果:1.脏腑功能失调参与MS发病,肾精亏虚是MS发病的根本,脾胃运化不足导致MS迁延不愈,肝脏参与MS免疫调控,肺宣降失司变生痰浊参与MS进展,心-肾-命门轴在MS病机中发挥重要作用,各个脏腑共同参与MS的疾病进展与病机演变。2.各组小鼠神经功能评分变化情况:空白组未发现神经功能缺损表现,其余各组于第4天出现易激惹现象,于第10天陆续发病,出现尾部无力、尾部拖地、肢体力弱、甚至瘫痪;第18天达到发病高峰,18 d后症状逐渐缓解。最高神经功能评分,与模型组比较,AAV-β组、中药组、AAV-β+中药组、西药组NSC125066明显降低。3.HE染色结果:模型组可见大部分神经元存在较重的细胞水肿,神经元有胞体皱缩深染现象,炎性细胞聚集Tubing bioreactors;中药组、西药组、AAV-β组、AAV-β+中药组均较模型组病变轻微;空白组细胞未见异常。LFB髓鞘染色结果:模型组可见大面积白质区域脱髓鞘改变,并且模型组脱髓鞘程度明显重于其他组,AAV-β组较中药组、AAV-β+中药组以及西药组脱髓鞘程度更为严重。4.炎症因子变化:与空白组比较,模型组IL-2、IL-23、IL-27、IFN-γ表达量显著升高,IL-35表达量显著降低;与模型组比较,中药组IL-2、IFN-γ、IL-23、IL-27显著降低,IL-35显著升高。红细胞中ATP含量:与空白组比较,模型组、AAV-β组红细胞中ATP含量显著降低。与模型组比较,中药组、AAV-βselleck NMR+中药组、西药组红细胞中ATP含量显著升高。5.Th17/Treg细胞比例:与空白组比较,模型组Th17显著上升,Treg显著降低。与模型组比较,AAV-β组、中药组、AAV-β+中药组与西药组Th17显著降低;西药组与AAV-β+中药组Treg显著升高。6.与空白组比较,模型组β-arrestin1、P2Y1、GFAP、P53、HDAC1、H3K9ac、H4K5ac升高,A1AR、GDNF显著降低;与模型组比较,AAV-β组、中药组、AAV-β+中药组、西药组β-arrestin1、P2Y1、GFAP、P53、HDAC1、H3K9ac、H4K5ac降低,A1AR、GDNF升高。以上数据大部分具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:1.MS的发病根本在于五脏功能失调,以肾精不足为主,各个脏腑共同参与MS的疾病进展与病机演变。2.益肾达络饮通过抑制EAE小鼠体内β-arrestin1缓解中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的炎性反应,调节免疫失衡,从而改善EAE小鼠的神经功能缺损症状。3.益肾达络饮抑制CNS中星形胶质细胞胶质化,调节CNS能量代谢,升高神经营养因子水平,促进神经再生。4.益肾达络饮通过抑制β-arretin1调控EAE小鼠组蛋白乙酰化,启动表观遗传修饰。