背景IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是最常见的原发性肾小球肾炎,由于IgAN的发病机制尚未完全清楚,目前仍缺乏可靠的特异性治疗;目前关于IgAN发病机制较为普遍接受的是多重打击学说,血循环中粘膜免疫来源的低糖基化IgA1增多是发病的起始环节。派尔集合淋巴结(Peyer’s patch,PP)是粘膜相关淋巴组织中粘膜诱导和效应重要的部位,是B淋巴细胞分化、成熟的主要场所。在免疫诱导过程中,PP表达CXCL13,CXCL13作为强烈吸引B淋巴细胞到次级淋巴组织进行成熟分化的趋化因子,可以反映次级淋巴组织中GC反应的活跃情况;其受体CXCR5可以作为B淋巴细lung immune cells胞从次级淋巴组织成熟迁移出的细胞的标记。在PP,被活化的B淋巴细胞,在肠道归巢受体CCR9、α4β7的趋化作用下,到达肠粘膜固有层,进一步发育成能分泌免疫球蛋白的浆细胞(主要是IgA)。BAFF(B淋巴细胞活化刺激因子)及其同源增殖诱导配体APRIL,可促进B淋巴细胞成熟分化为浆细胞,并可激活NF-kB等炎症相关通路;尤其是在免疫球蛋白类别转换中,可促使浆细胞发生向分泌IgA的类别转换,从而在半乳糖缺陷 IgAl(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)产生中扮演重要角色。广安门医院肾病科长期致力于中医药治疗IgA肾病的基础与临床研究,认为肺脾气虚,卫气不固,感受外邪(主要是风湿热毒之邪),邪热伤肾是IgAN发病的中医病因病机,治宜益气固表,清热解毒,祛湿活血。临床应用协定处方益气清解方(Yi-qi-qing-jie Formula,YQQJ)发现,该药不仅能降低患者蛋白尿,改善肾功能,同时还可缓解患者粘膜炎症,降低患者血清Gd-IgA1水平。中医学卫气理论与现代医学粘膜免疫应答理论内涵是相一致的,因此我们通过建立粘膜免疫诱导的IgAN小鼠模型,探讨粘膜免疫失调、B淋巴细胞异常活化与归巢参与IgAN发病的具体机制及益气清解方干预的治疗作用,为“益气清热解毒法”治疗IgAN提供现代生物医学依RepSox采购据。目的对粘膜免疫诱导的IgA肾病小鼠模型予中药益气清解方干预,探讨粘膜免疫应答中B淋巴细胞异常活化与归巢参与IgAN发病的机制及益气清解方的干预作用和机制。方法取6周龄,约20g,SPF级的BALB/c小鼠,采用粘膜免疫诱导的方法造模:自由饮用含0.1%牛γ-球蛋白(Bovine Gamma Globulin,BGG)的饮用水9周,其间在第7周腹腔注射BGG溶液+弗氏完全佐剂1:1乳化混合物后,9周后连续3天尾静脉注射0.1ml由生理Alpelisib溶解度盐水配成的0.1%BGG溶液,继续饮用含0.1%的BGG溶液。以24小时UTP的检测、随机尿中红细胞位相检查、肾组织免疫荧光法检测IgA沉积、PAS染色观察系膜区病理损伤等对模型成模评价。成模后分为;模型组(n=9),继续自由饮用0.1%BGG溶液;益气清解方(YQQJ)组(n=9),予益气清解方水煎剂56.4g/kg每日一次灌胃;泰它西普组(n=9),予TACI抗体融合蛋白(Transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor-immunoglobulin fusion protein,TACI-Ig)隔日一次 5mg/kg 皮下注射;正常(Control)组(n=9),继续自由饮用生理盐水,共8周。对各处理组收集标本进行24小时UTP、尿RBC位相、肾组织IgA免疫荧光检测和PAS染色结合图像分析评价肾脏病理、酶联免疫吸附检测各组血清slgA水平、派尔集合淋巴结(Peyer’s patch,PP)计数及直径测量、免疫组织化学结合图像分析检测B淋巴细胞活化刺激因子(B-cell activating factor,BAFF)、趋化因子CXCL13及其配体CXCR5在PP的表达、DigitalWestern检测脾脏组织BAFF表达,流式细胞术检测PP、外周血中表达肠道归巢受体的IgA分泌(IgA+)细胞比例。结果一、模型评价小鼠进行IgAN造模后1.一般情况:状态逐渐萎靡,活动减少;粪便变稀;饮水量和体重造模组与Control组无明显变化(P均>0.05)。2.24小时尿蛋白排泄量(UTP):造模2周后,UTP开始有上升趋势,并在第9周尾静脉注射后上升最为明显。第9周末,造模组与Control组比较,19.98±2.683vs 7.066±1.748(mg/d)P=0.0038。尿 RBC:尾静脉注射后计数增多,造模组与 Control 组比较,25.33±5.344 个/HPF vs 1.25±0.25 个/HPF,P=0.0137。造模组和Control组各处死1只小鼠留取肾组织,肾组织IgA免疫荧光检测:Control组肾组织免疫荧光IgA(+),造模组肾小球系膜区IgA(++),比Control组沉积增多。肾组织PAS染色可见造模较Control组系膜基质及系膜细胞增多。二、益气清解方对IgA肾病小鼠的治疗作用1.UTP:第17周(给药8周后)YQQJ组与IgAN组比较,UTP减少,P<0.001,与 Control 组比较,P>0.999;TACI-Ig 组与IgAN 组比较,P=0.006,与Control组比较,P=0.644。2.尿RBC:第17周,与Control组比较,IgAN组平均每视野RBC数明显增加,P=0.019;YQQJ干预后相比IgAN组RBC减少,P=0.031;TACI-Ig干预后,与模型组比较有减少趋势,P=0.296,无统计学差异。3.肾组织IgA免疫荧光:第17周,IgAN组相比Control组,荧光评分增加,,P=0.003;YQQJ组相比IgAN组荧光评分减少,P=0.02,与Control组相比无明显变化,P=0.764;TACI-Ig干预后比IgAN组,P=0.239,与Control组相比,P=0.237。4.肾组织PAS染色:第17周,Control组肾小球结构完整、体积和固有细胞数量大小正常,IgAN组相比Control组肾小球系膜细胞增生评分增大,P=0.03,系膜基质增生评分增大,P=0.017。YQQJ干预后,相比较IgAN组,系膜细胞增生评分有减少趋势,但P=0.228,系膜基质增生评分减少,P=0.042。TACI-Ig干预后,相比较IgAN组,系膜细胞增生评分均有减少趋势,但P=0.546,不具有统计学差异;而系膜基质增生评分减少,P=0.04。三、益气清解方对IgA肾病小鼠粘膜免疫反应的调控作用1.各组 sIgA 水平:第 17 周,IgAN 组比 Control 组增加,P=0.0001,YQQJ干预后比IgAN组降低,P=0.0001,TACI-Ig干预后也比IgAN组下降,P=0.04。2.各组PP总数及平均直径:第17周,与Control组相比,IgAN组PP个数增加,P=0.008;PP平均直径增加,P=0.002。与IgAN组相比,YQQJ组PP数量减少,P=0.047;PP平均直径变小,P=0.009。与IgAN组相比,TACI-Ig组,PP数量也变小,P=0.047;PP平均直径无明显变化,P=0.064。3.各组PP中B淋巴细胞活化及迁徙状态分析3.1 派尔集合淋巴结免疫组化CXCL13、CXCR5表达:第17周,IgAN组相比Control组,CXCL13免疫组化H评分升高,P=0.042。YQQJ组相比IgAN组减少,P=0.030。TACI-Ig组相比IgAN组CXCL13表达水平无明显变化,P=0.057。IgAN组相比Control组CXCR5表达水平增加,P=0.047。YQQJ组相比IgAN组CXCR5表达水平减少,P=0.046。TACI-Ig组相比IgAN组CXCR5表达水平无明显变化,P=0.053。派尔集合淋巴结BAFF表达:第17周,IgAN组:相比Control组,BAAF总体表达水平增加,P=0.014。YQQJ组:相比IgAN组,总体表达水平减少,P=0.046。各部位BAFF表达均减少。TACI-Ig组:相比IgAN组表达水平无明显变化,P=0.06。3.2 Digital Western Blot检测脾脏组织BAFF表达水平第17周,IgAN组比Control组表达增加,P=0.029,YQQJ组相比IgAN组表达减少,P=0.043,TACI-Ig组相比IgAN组也有减少趋势,P=0.203。3.3 PP、外周血表达肠道归巢受体的IgA+B淋巴细胞占总B淋巴细胞比例血液中IgA+细胞肠道归巢受体表达情况:第17周,IgAN组比Control组,活化的IgA+浆细胞中表达肠道归巢受体占比(CCR9+α4β7+CD45R+CD38+/CD19+IgA+)有明显升高,0.60±0.10 vs 0.14±0.12(%),P=0.0079。YQQJ 干预后,YQQJ 组相比 IgAN 组,活化的 IgA+B淋巴细胞和浆细胞中表达肠道归巢受体占比均有所降低,分别为0.02±0.02 vs 0.11±0.05(%),P=0.04 和 0.38±0.23 vs 0.60±0.10(%),P=0.009。TACI-Ig干预后对比模型组,活化的IgA+B淋巴细胞表达肠道归巢受体占比降低,0.01±0.01 vs 0.11±0.55(%),P=0.025。派尔集合淋巴结流式细胞术结果:第17周,YQQJ干预后,YQQJ相比IgAN组,趋化迁移的B淋巴细胞增加(向趋向Control组的方向变化),P=0.014。活化的IgA+浆细胞中表达肠道归巢受体占比升高,P=0.047。TACI-Ig干预后趋化迁移的B淋巴细胞和活化的IgA+浆细胞中表达肠道归巢受体占比有升高趋势(趋向Control组方向),P值分别为P=0.04,P=0.072。结论1.通过改良的粘膜免疫诱导造模方法(口服联合尾静脉注射BGG及腹腔注射BGG+弗氏完全佐剂混合物加强免疫)成功建立IgA肾病小鼠模型,提供粘膜免疫参与IgAN发病机制的证据。2.在粘膜免疫诱导模型中,进入血循环的粘膜免疫来源的IgA分泌B淋巴细胞(IgA+B/浆细胞)的增多,血清致病性IgA水平升高。3.YQQJ可减轻粘膜免疫诱导的IgA肾病模型小鼠的血尿、蛋白尿,减少系膜区IgA沉积及相应病理损伤;这种治疗作用与该药减轻模型小鼠粘膜免疫过度活化,减少粘膜免疫来源的IgA分泌细胞进入血循环、降低血清sIgA水平有关。