癌症被视为人类健康的主要威胁之一,近年来发病率呈大幅上升趋势,利用放射线杀伤肿瘤细胞,是癌症常规治疗手段之一。然而,肺癌及胰腺癌等恶性肿瘤对常规射线响应差,临床治疗效果不佳,严重限制了放射治疗的潜力。因此,如何有效地提升肿瘤放射治疗的杀伤率就成为了当前的主要难题。铁死亡(Ferroptosis)是一种新型的细胞死亡方式,其特点是铁的累积和脂质过氧化物的增加。线粒体自噬作为清除损伤线粒体的手段,可以引起铁的累积和活性氧(Reactive oxygen sCSF AD biomarkerspecies,ROS)的堆积来诱导铁死亡。脂滴(Lipid droplets,LDs)作为脂肪酸存储的细胞器,在应激状态下LDs能够通过自噬作用被溶酶体降解导致细胞内游离脂肪酸(Free fatty acids,FFAs)的含量升高和脂质过氧化风险急剧增加。此外,LDs也会与线粒体形成线粒体-LD拴系,在线粒体自噬作用下拴系被溶酶体包裹并降解,同样起到抑制肿瘤细胞增殖的目的。电离辐射是一种能够同时引起线粒体自噬和铁死亡的手段,且其引起线粒体自噬和铁死亡的程度均与辐射剂量相关。文献报道,线粒体自噬与铁死亡相互影响,但是到目前为止,我们还难以确定辐射背景下铁死亡与线粒体自噬之间存在怎样的联系,对线粒体自噬机制的调控能否用于提升肿瘤的杀伤效率,促进电离Entinostat溶解度辐射引起的铁死亡,以期为开发新的肿瘤治疗范式提供思路,仍有待深入研究。综合上述的研究背景,我们提出一个假设,即:“电离辐PUN30119 molecular weight射通过线粒体自噬来调控线粒体与LDs互作,进而引起溶酶体途径降解LDs释放FFAs,促进铁死亡发生来抑制肿瘤细胞增殖”。为了验证该假设,我们以人非小细胞肺癌A549细胞,人胰腺癌PANC-1和SW1990细胞及小鼠黑色素瘤B16和S91细胞作为研究对象。利用细胞增殖、克隆形成、实时定量PCR、蛋白免疫印迹、免疫组化、免疫荧光和免疫共沉淀等技术手段,探索电离辐射通过诱导线粒体自噬促进铁死亡发生的机理研究。主要结果如下:(1)X射线和碳离子束照射均能引起人非小细胞肺癌A549细胞,人胰腺癌PANC-1和SW1990细胞以及小鼠黑色素瘤B16和S91细胞发生铁死亡,同时在动物模型也引起了B16和S91黑色素瘤的铁死亡,抑制了肿瘤生长。利用各种细胞死亡抑制剂也进一步证明了铁死亡是电离辐射引起的细胞主要死亡方式之一。随后,通过对电离辐射后肿瘤代谢途径的分析,发现电离辐射能够上调细胞的糖和谷氨酰胺代谢,引起ROS大量产生,并上调铁转运蛋白SLC39A14和脂质过氧化标志蛋白酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Acyl-Co A synthase long-chain family member 4,ACSL4)的表达来诱导肿瘤细胞发生脂质过氧化。同时,辐射关闭了胱氨酸/谷氨酸反向转运体(a cystine/glutamate antiporter system,system X_C~-),下调谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的合成,最终导致铁死亡。(2)针对铁死亡的诱因-细胞内FFAs的探索:我们锚定脂肪酸来源-LDs,利用透射电镜或免疫荧光对辐照后的LDs进行追踪,发现电离辐射通过引起肿瘤细胞LDs体积变大并向线粒体靠近形成线粒体-LD拴系,由LDs向线粒体提供脂肪酸。同时,依赖于线粒体自噬作用,由辐射引起的损伤线粒体-LD拴系最终被溶酶体包裹并降解,释放FFAs促进铁死亡发生。此外,通过免疫共沉淀实验也证明了线粒体自噬关键因子Parkin和BNIP3能够直接作用于LDs生成及参与线粒体互作相关蛋白的表达。相关结果表明:在辐射背景下,由线粒体自噬引起的FFAs释放是铁死亡发生的主要原因。(3)电离辐射诱导的线粒体自噬明显参与了铁死亡的进程,二者有着密切的联系。本研究从正反两个方面进行了验证,首先电离辐射联合线粒体自噬诱导剂CCCP(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)或VPA(Valproic acid)处理均能显著加速铁死亡发生。反之,不论是线粒体自噬抑制剂Mdivi-1还是利用RNA干扰手段降低Parkin或BNIP3的表达,均下调了由电离辐射引起的铁死亡。此外,在C57BL/6小鼠皮下植入了野生型、Parkin敲除和过表达的B16和S91细胞,当肿瘤体积测量到50 mm~3时,给予4 Gy的X射线照射,结果发现Parkin过表达介导的高水平线粒体自噬能够显著促进肿瘤铁死亡,延长荷瘤小鼠生存周期。相关结果表明:铁死亡是一种线粒体自噬依赖型的细胞死亡方式,在辐射作用下,线粒体自噬对于铁死亡的发生至关重要。本研究通过以上结果得出如下结论:电离辐射通过上调能量代谢引起脂质过氧化发生,抑制system X_C~-,下调GPX4的水平,降低细胞抗氧化能力;同时,电离辐射诱导LDs向线粒体靠近形成线粒体-LD拴系,损伤的线粒体引发线粒体自噬途径降解线粒体-LD拴系,释放FFAs引起铁死亡发生。最终,我们的研究确立了由Parkin/BNIP3介导的线粒体自噬在调节肿瘤细胞铁死亡中的关键作用,相关研究为肿瘤放疗研究提供了新的发展方向。