研究背景:甲状腺各项参数在妊娠期间是动态改变的,其与一些妊娠结局存在相关性,尤其是对于一些亚临床甲状腺疾病,但目前尚缺乏一致的结论。甲状腺自身免疫(Thyroid autoimmunity,TAI)是常见的内分泌自身免疫性疾病,在育龄期妇女中更为常见,患病率可达10-20%。研究发现与非TAI女性相比,TAI女性发生自然流产的风险增加了2-3倍,但具体机制尚不清楚。α-烯醇化酶(Alpha-enolase,ENO1)属于烯醇化酶家族成员之一,存在于大多数真核生物体内。在TAI患者和甲状腺球蛋白免疫诱导的实验性自身免疫甲状腺炎小鼠模型中均发现血清ENO1抗体(ENO1Ab)水平显著升高。抗原表位是诱导免疫应答的产生以及与抗体发生特异反应的基本结构单位。ENO1蛋白的P6表位是指氨基酸(Amino acid,aa)168-183。已有研究发现血清ENO1Ab和ENO1-P6Ab在TAI自然流产女性中均表达增多。其中aa168-175为P6特有氨基酸序列,位于人源ENO1三维结构的表面,在免疫应答过程中容易被B细胞所识别。肠道菌群被发现既参与TAI的发生,也与自然流产的发生具有相关性,尤其是在抗体阳性患者中(抗心磷脂抗体,抗核抗体,抗β2-糖蛋白1抗体)。两种来自不同生物体的分子(如人类和微生物),其呈现给免vaginal infection疫系统的抗原表位肽如果足够相似,可引发免疫系统发生不适当的免疫反应。但目前缺乏临床观察明确证明ENO1-P6-aa168-175Ab水平与TAI自然流产的关系以及肠道菌群是否可能通过其相似的抗原表位引起与TAI自然流产相关特异抗体表达的增多。研究目的:(1)分析妊娠各期甲状腺疾病(包括亚临床甲状腺疾病)对常见不良妊娠结局的影响;(2)利用人工合成的ENO1、ENO1-P6、ENO1-P7、ENO1-P6-aa168-175、ENO1-P7-aa184-194肽段检测经筛选入组人群中上述抗原表位特异抗体的表达水平,并分析其与TAI自然流产的关系;(3)收集粪便标本进行细菌16S r DNA测序,利用生物信息学方法分析可能参与诱导引起TAI自然流产相关ENO1-P6-aa168-175表位特异抗体产生的肠道起源。研究方法:1、第一部分研究对象来自于北部战区总医院(和平院区)妇产科参加“东北区域母胎-儿童-青少年队列研究”中完成妊娠三期及产后妊娠结局随访的患者。按照已规定的纳入标准和排除标准筛选入组人群,最终纳入390名孕妇。记录所有参与者的基本信息,采用电化学发光法测定血清促甲状腺素、游离甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸、甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,Tg Ab)水平,对上述信息整合后进行统计分析。2、第二部分基于“东北区域母胎-儿童-青少年队列研究”和我院妇产科门诊就诊对象,按照规定的纳入标准和排除标准筛选入组人群,最终纳入120人,记录所有参与者的基本信息、甲状腺功能等临床指标,收集上述入组人群的血清,利用合成的人源ENO1、ENO1-P6、ENO1-P7、ENO1-P6-aa168-175、ENO1-P7-aa184-194作包被抗原,经ELISA方法检测各组妇女血清中ENO1、ENO1-P6、ENO1-P7、ENO1-P6-aa168-175、ENO1-P7-aa184-194抗原表位特异抗体表达水平。3、收集第二部分人群的粪便标本,进行细菌16S r DNA测序,分析TAI自然流产孕妇肠道菌群特点。结合对人源ENO1-P6-aa168-175氨基酸序列的比较分析,确定可能引起TAI自然流产相关ENO1-P6-aa168-175表位特异抗体产生的肠菌烯醇化酶的氨基酸序列,进一步验证其抗体表达水平。结果:1、低T4血症是非TAI女性在妊娠早期(T1)和妊娠中期(T2)最常见的甲状腺疾病,而亚临床甲状腺毒症(SCT)在TAI和非TAI女性的妊娠晚期(T3)最常见。2、在390名孕妇中,T1期TAI和低T4血症与妊娠期高血压风险增加显著相关;T1期亚临床甲状腺功能减退症与产后出血风险较高独立相关;T1期SCT与小于胎龄儿的风险升高有显著相关性;在整个孕期甲状腺功能均正常的孕妇中,T3期TPOAb~+/Tg Ab~+为早产和低出生体重儿的独立危险因素。3、在TAI妇女中,发生自然流产者血清中ENO1Ab表达水平显著高于无自然流产者;在发生自然流产者中,TAI妇女血清中ENO1Ab的表达水平显著高于非TAI的妇女。同样,在TAI妇女中,发生自然流产者血清中ENO1-P6Ab的表达水平显著高于无自然流产者;在发生自然流产妇女中,TAI妇女血清中ENO1-P6Ab的表达水平显著高于非TAI妇女。在TAI妇女中,发生自然流产者血清中人源ENO1-P6-aa168-175Ab的表达水平显著高于无自然流产者;TAI无流产组和非TAI自然流产组血清中人源ENO1-P6-aa168-175Ab的表达水平显著高于非TAI无流产组。四组妇女中血清中人源ENO1-P7Canagliflozin小鼠Ab和人源ENO1-P7-aa184-194Ab表达水平均无显著差异。4、运用16S r DNA测序技术,发现孕妇和非妊娠妇女在疣微菌纲、疣微菌门、粪便拟杆菌、Fusobacterium＿mortiferum中存在差异。在孕妇中,TAI自然流产组相较于非TAI自然流产组和TAI无自然流产组肠道微生物物种丰度增高,菌群分布存在差异。LEf Se分析提示拟杆菌目、拟杆菌门、肠杆菌科、肠杆菌目等在非TAI流产组中丰度显著高于TAI流产组;普雷沃氏菌属、经黏液真杆菌属、巨单胞菌属、大肠埃希氏菌等在TAI流产组中显著高于非TAI流产组;Agathobacter、Ruminococcus＿lactaris在TAI非流产组中显著高于TAI流产组;嗜酸杆菌、考拉杆菌属、氨基酸球菌科等在TAI流产组中显著高于TAI非流产组。5、根据对孕妇肠道菌群相对丰度值统计得出在种水平上,TAI自然流产组的本菌(本菌)、Bacteroides＿fluxus和Marseillibacter＿massiliensis分别高于TAI无流产组和非TAI自然流产组。使用Pub Med蛋白序列数据库查询上述菌种烯醇化酶氨基酸序列,使用BLAST功能与人源ENO1氨基酸序列对比获得同源性数据,其中本菌烯醇化酶164-171与人源ENO1-P6-aa168-175相似性为88%。6、在非TAI孕妇中,发生自然流产者本菌烯醇化酶aa164-171Ab水平显著高于无流产者,在无流产妇女中,TAI组本菌烯醇化酶aa164-171Ab水平显著高于非TAI组,本菌烯醇化酶aa180-190Ab表达水平在四组间未见显著差异。7、吸收实验结果显示当用本菌烯醇化酶aa164-171进行预吸附,相较于TAI流产组,非TAI流产组和TAI无流产组中人源ENO1-P6-aa168-175Ab表达水平的差值明显增加,当用人源ENO1-P6-aa168-175进行预吸附,相较于非TAI流产组和TAI无流产组,TAI流产组本菌烯醇化酶aa164-171Ab表达水平的差值明显增加。结论:1、在妊娠早期和晚期监测甲状腺功能及其自身抗体对于防止不良妊娠结局均有重要意义。2、甲功正常的TAI妇女循环中ENO1Ab、ENO1-P6Ab、ENO1-P6-aa168-175Ab的表达与其自然流产发生风险相关,而血ENO1-P7Ab、ENO1-P7-184-194Ab无相关性。提示ENO1-P6-aa168-175Ab的表达可能是甲功正常的TAI妇女发生自然流产的一个重要独立危险因素。3、对全部肠菌的相对丰度分析提示,发生过自然流产的甲功正常TAI妇女肠菌中本菌的相对丰度既显著高于甲功正常TAI无流产妇女,也明显高于甲功正常非TAI流产者。本菌烯醇化酶aa164-171与https://www.selleck.cn/products/mcc950-sodium-salt.html人ENO1-P6-aa168-175高度相似。我们对其抗体的分析表明,本菌暴露不仅可能在部分TAI女性中触发对人ENO1-P6-aa168-175的交叉免疫反应,进一步促进自然流产的发生;而且机体所产生的针对细菌烯醇化酶aa164-171的抗体还可能干扰对人ENO1-P6-aa168-175自身抗体的检测。