研究背景与目的:卵巢储备功能下降(decreased ovarian reserve,DOR)可以导致月经紊乱、生育力下降甚至不孕。DOR患者在体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)中常发生卵巢低反应(poor ovarian response,POR),表现为获卵少、可移植胚胎少,成功率低。临床研究发现生长激素(growth hormone,GH)能提高POR患者IVF-ET临床妊娠率,可能通过改善卵母细胞质量及子宫内膜容受性发挥作用。因受伦理限制,难以对DOR患者卵巢组织进行研究,因此缺乏GH改善DOR患者卵巢生殖功能的直接证据,具体作用机制也未完全明确,GH的有效剂量也未统一,DOR动物模型有助于解决这一难题。目前DOR建模方法不统一,各种方法的建模效果缺乏对比研究;GH改善DOR小鼠模型卵巢生殖功能的文献少,研究结论存在争议,作用机制不完全明确。目前化疗药物环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)、顺铂(cisplatin,CDDP)建立DOR小鼠模型采用较广泛,因此,本研究比较两者建立DOR小鼠模型的效果,选择建模效果确切、周期短、经济模型进行GH治疗性研究;从卵巢组织病理学、血清学水平比较不同剂量GH改善DOR小鼠卵巢生殖功能的效果,通过卵巢组织转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)探索GH改善DOR小鼠卵巢生殖功能的作用机制,为改善DOR患者IVF-ET助孕结局提供治疗措施及及理论依据。材料与方法:健康6～8周龄雌性昆明小鼠,处在同一动情周期,采用CTX或CDDP建立DOR小鼠模型。小鼠随机分为5组,每组6只:CTX-DOR组,腹腔注射CTX 50mg/kg,之后连续14天腹腔注射CTX 8 mg/kg;CTX-阴性对照组,连续14天腹腔注射0.4 m L生理盐水;CDDP-DOR组,连续7天腹腔注射CDDP 1.5 mg/kg;CDDP-阴性对照组,连续7天腹腔注射0.4 m L生理盐水;未干预组,不给HBeAg hepatitis B e antigen予任何干预。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组血清抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、卵泡刺激素(follicle-stimulation hormone,FSH)、雌二醇(estradiol,E_2)水平,卵巢组织切片采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,显微镜下计数各级发育卵泡数,测量卵巢皮质厚度。选择DOR病理改变最典型的模型进行GH干预性研究。建立DOR小鼠模型后随机分成4组,每组10只:GH低剂量组,连续21天腹腔注射GH 0.4 mg/kg;GH中剂量组,连续21天腹腔注射GH 0.8 mg/kg;GH高剂量组,连续21天腹腔注射GH 1.6 mg/kg;CDDP-DOR组:连续21天腹腔注射生理盐水0.2 m L。设置阴性对照组,从开始建模日至GH干预结束日连续每日注射0.2 m L生理盐水(n=10);未干预组:不予任何干预(n=10)。采用ELISA检测血清AMH、FSH、E_2水平。卵巢组织切片HE染色,显微镜下计数各级发育卵泡数,测量卵巢皮质厚度。采用RNA-seq检测GH干预效果最佳的剂量组卵巢组织,与CDDP-DOR组、未干预组比较差异基因表达情况,并进行差异基因功能富集分析。结果:1.CTX及CDDP建立DOR小鼠模型的效果比较1.1 CTX-DOR与CTX阴性对照组、未干预组比较,CDDP-DOR组与CDDP阴性对照组、未干预组比较,均出现活动度增加、精神亢奋、皮毛光泽度下降。CDDP-DOR组比CTX-DOR组上述表现出现早(第3天vs.第5～6天)。CDDP-DOR组小鼠体重较未干预组显著下降(35.00±2.31 g vs.38.52±1.68 g,P<0.05)。1.2 CTX-DOR组与CTX阴性对照组、未干预组比较,CDDP-DOR组与CDDP阴性对照组、未干预组比较,卵泡呈囊性扩张或塌陷,卵泡颗粒细胞减少,间质增生伴大量炎性细胞浸润;测量卵巢皮质变薄,髓质增厚,皮质/髓质比值下降,但无统计学差异(P>0.05)。1.3 CTX-DOR组与CTX阴性对照组、未干预组比较,CDDP-DOR组与CDDP阴性对照组、未干预组比较,均出现原始卵泡数减少、闭锁卵泡数增加,CDDP-DOR组还出现次级卵泡数、窦状卵泡数减少(P<0.05)。CDDP-DOR组比CTX-DOR组闭锁卵泡数多(P<0.05),原始卵泡数、次级卵泡数、窦状卵泡数少,但无统计学差异(P>0.05)。1.4 CTX-DOR组与CTX阴性对照组、未干预组比较,CDDP-DOR组与CDDP阴性对照组、未干预组比较,血清FSH水平升高,AMH、E_2水平降低(P<0.05)。2.GH对CDDP-DOR小鼠卵巢生殖功能的影响2.1 GH干预组小鼠行为活动、精神状态、皮毛光泽度、摄食能力与阴性对照组及未干预组小鼠无明显差异。GH高剂量组小鼠体重比GH中剂量组、CDDP-DOR组高(P<0.05)。2.2 GH干预组比CDDP-DOR组小鼠卵巢充血、炎性浸润有改善,皮质增厚,髓质变薄,皮质/髓质比值升高,且呈明显剂量依赖关系,其中高剂量组与CDDP-DOR组比较有统计学差异(P<0.05)。GH高剂量组与未干预组相比,卵巢皮质厚度、髓质厚度、皮质/髓质比值均无统计学差异(P>0.05)。2.3 GH干预组比CDDP-DOR组原始卵泡数、次级卵泡数多,GH中剂量及GH高剂量组比CDDP-DOR组闭锁卵泡数减少(P<0.05)。GH高剂量组原始卵泡数比GH低剂量及GH中剂量组多(P<0.05),次级卵泡数、窦状卵泡数多,闭锁卵泡数少,但无统计学差异(P>0.05)。GH高剂量比未干预组次级卵泡数增加(P<0.05)。2.4 GH干预组比CDDP-DOR组血清FSH水平降低、E_2水平升高(P<0.05),AMH水平升高,但仅GH高剂量组与CDDP-DOR组有统计学差异(P<0.05)。AMH、E_2水平随着GH剂量升高而增加,FSH水平随着GH剂量增加而下将,但三组比较无统计学差异(P>0.05)。3.GH对CDDP-DOR小鼠卵巢组织转录组学的影响3.1 CDDP-DOR组与未干预组差异基因包括Atp5o、Ndufs6等与线粒体能量代谢相关基因,Cyp2b10、Cyp19a1、LHB等与生殖内分泌功能相关基因。显著富集的功能主要与核糖体及蛋白合成、线粒体能量代谢、氧化还原反应相关,显著富集的通路主要为产热效应、氧化磷酸化等。3.2 GH高剂量组与CDDP-DOR组差异基因包括Igkc、Jchain、Igha等免疫相关基因,Mecr、Atp5o、mt-Rnr2、Cyp11a1等与线粒体能量代谢相关基因,FSHR等与生殖功能相关基因,显著富集的功能主要与蛋白合成、氧化还原酶活性有关。显著富集的通路主要为细胞外基质的相互作用等。3.3 GH高剂量组与未干预组差异基因包括Mrps18b、Me3、mt-Nd2等与线粒体能量代谢相关基因。显著富集的功能主要与核糖体合成相关。GH高剂量组与未干预组未见显著富集通路。结论:CTX和CDDP均可建立DOR小鼠模型,CDDP建模周期更短,DOR病理改变更典型。GH能改善CDDP-DOR小鼠卵巢生殖功能,呈剂量依赖性,高剂量GH干预后EmpagliflozinDOR小鼠卵泡发育及性激素基本达到正常水平。GH可能通过调整卵selleck Mirdametinib巢线粒体能量代谢、氧化还原反应、蛋白质及核糖体合成相关基因表达,改善DOR小鼠卵巢生殖功能。