肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是一种危害严重的人兽共患病原菌。近年来,ExPEC在猪群中逐渐流行,对养猪业造成严重损失。区别于致腹泻大肠杆菌,ExPEC能够引起猪的全身性感染,导致败血症、脑膜炎、肺炎等,然而其致病机制有待阐明。ExPEC造成全身感染过genetic constructs程中克服血液中的免疫杀伤和营养限制,从而在血液循环中存活和增殖是其致病的关键环节,潜在机制有待研究。本研究利用RNA-seq分析了猪ExPEC在血清条件下的基因表达变化,利用CRISPRi技术鉴定了这一系列差异表达基因对猪ExPEC血清存活的影响。利用转座子随机突变技术鉴定了一系列与猪ExPEC血清存活相关基因。取得的主要结果如下:1、通过对ExPEC PCN033菌株在血清孵育前后进行转录组测序,发现与血清孵育后有大量基因发生差异表达,GO数据富集结果显示,在与血清孵育15min后,大量核苷酸代谢、核糖体亚基形成等过程基因的表达发生差异,随着与血清孵育时间延长,孵育1 h后,大量金属离子结合过程、无机离子稳态等过程的基因出现差异表达。而KEGG数据富集显示,在与血清孵育前后以及孵育不同时间,核苷酸代谢、氨基酸代谢、DNA复制、铁载体生物合成等通路基因都显著上调,下调基因则富集在氨基酸降解、TCA循环等通路,通过分析15min和1 h血清孵育组中前30个显著上调的基因,发现了大量基因都与核苷酸从头合成和铁摄取系统相关,如:ent C、fes、chu T、pur T、pyr B等。结果表明铁摄取系统以及核苷酸代谢相关基因对于肠外致病性大肠杆菌在血清中存活至关重要。2、针对上述在血清中的部分差异表达基因,利用CRISPRi技术对其进行下调表达,并检测了其在血清存活中的影响,结果发现当fep E、fep A、ent C、chu A、chu T、feo A、fes、ent D等铁摄取基因的表达被抑制后,ExPEC在血清中的存活能力显著下降,表明铁摄取相关基因是ExPEC在血清中存活的一类关键基因。3、大量ExPEC的核苷酸从头合成相关基因在血清条件下也发生了显著差异表达,因此进一步探究了核苷酸从头合成基因的表达调控机制,发现缺失转录调控因子pur R和核苷酸警报分子(p)pp Gpp后,嘌呤合成的相关基因pur H、purK、purE、purN均表达上调,这也就证明了(p)ppGpp和PurR会下调嘌呤生物合成过程。4、利用MDorsomorphin浓度ariner随机转座突变技术构建了ExPEC PCN033的随机突变文库,检测了4500个转座突变体在血清中存活情况,鉴定得到18株血清存活能力显著下降的突变体。通过转座子插入测序对转座子插入位点进行鉴定,发现与血清存活相关的基因包括purH、purD、pyrC、aroA、wecA、rfaH、narI,它们主要与核苷酸从头和胞外多糖生物合成途径相关。5、将上述获得的核苷酸相关基因突变的突变菌株进行一系列的表型验证,pur H、pur D突变会导致ExPEC PCN033基本无法在血清中存活,而外源添加核苷酸则能恢复在血清中的生长,表明ExPEC存在核苷酸摄取系统。同时,观察到突变体在血清中的形态异常,推测可能是由于核苷酸从头合成途径的缺失会影响ExPEC PCN033包膜完整性以及DNA复制从而影响其在血清中的存活。本研究发现猪ExPEC在血清中发生了显著的基因差异表达,且差异表达基因主要富集在铁摄取系统和核苷酸代谢相关通路,并发现Pur R和(p)pp Gpp和Pur R会抑制嘌呤生物合成过程。在全基因组范围内鉴定了一系列血清存活相关基因,并初步探究了这selleck化学些基因在血清存活中的作用及机制。本研究将为揭示ExPEC的致病机制,挖掘新型抗菌药物靶标奠定了基础。