猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)在临床上常引起初孕母猪发生繁殖障碍性疾病,给养猪业带来巨大的经济损失。猪胎盘滋养层细胞(PorcineDibutyryl-cAMP体内 Placental trophoblast cells,PPTCs)是猪胎盘屏障的重要组成部分,在猪胎盘形成和胚胎发育过程中发挥重要作用,也是PPV攻击的主要靶细胞。细胞程序性坏死是非凋亡形式细胞死亡的一种,表现为靶细胞膜破裂,细胞内容物释放,诱发局部组织发生严重的炎症反应,目前已有研究证明,IAV等多种病毒在感染宿主细胞后可以引起细胞程序性坏死。本实验室前期研究发现,PPV感染后期的PPTCs出现了非凋亡形式细胞死亡,然而,这些非凋亡形式死亡细胞是否是程序性坏死以及具体机制迄今尚不清楚。因此,本研究拟抑制PPV感染导致的细胞凋亡,观察细胞形态、测定细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放并检测程序性坏死关键蛋白的表达水平,探究PPV感染PPTCs是否导致细胞发生程序性坏死。进一步构建一系列细胞程序性坏死过程中宿主细胞关键调控基因缺失的PPTCs细胞株,最后利用这些细胞株研究ZBP1/Caspase8/RIP3/MLKL通路各个蛋白在PPV诱导PPTCs程序性坏死过程中的作用及机制。研究取得以下结果。1.PPV感染诱导PPTCs发生程序性坏死用细胞凋亡抑制剂Ac-DEVD-CHO预处理PPTCs 1 h后,再以1 MOI PPV感染细胞,光学显微镜观察细胞形态发现,感染48 h和72 h的细胞出现肿胀、破裂和界限不清等病变,透射电镜观察发现,感染72 h的细胞出现肿胀、空泡化、细胞器不规则和膜破裂等典型程序性坏死特征,LDH释放量测定结果显示,与感染0 h相比,PPV感染24 h PPTCs的LDH释放量显著增加(P<0.05),感染48 h和72 h PPTCs的LDH释放量极显著增加(P<0.01);western blotting检测p-MLKL结果显示,与感染0 h相比,PPV感染24 h细胞内p-MLKL表达水平显著升高(P<0.05),感染48 h和72 h p-MLKL表达水平极显著升高(P<0.01)。激光共聚焦检测MLKL亚细胞定位情况发现,在MOCK组PPTCs中MLKL定位于细胞质,PPV感染72 h后,MLKL定位于细胞膜。west购买BAY 73-4506ern blotting检测RIP3/Caspase8表达水平结果显示,与感染0 h相比,PPV感染24 h细胞内RIP3表达水平显著升高(P<0.05),感染48 h和72 h RIP3表达水平极显著升高(P<0.01),而在PPV感染24 h、48 h和72 h细胞内Caspase8表达水平差异不显著(P>0.05)。western blotting检测ZBP1表达水平,结果显示,与感染0 h相比,PPV感染24 h细胞内ZBP1表达水平显著升高(P<0.05),感染48 h和72 h ZBP1表达水平极显著升高(P<0.01)。zbp1 si RNA预处理PPTCs 12 h后感染1 MOI PPV,72h测定细胞LDH结果显示,与si-NC组相比,si-zbp1组LDH释放量显著降低(P<0.05)。2.成功构建PPTCs~(zbp1-/-)、PPTCs~(caspase8-/-)、PPTCs~(rip3-/-)和PPTCs~(mlkl-/-)基因敲除细胞株分别构建成功靶向于zbp1(352、368、403位点)、caspase8(219、715、721位点)、rip3(300、376、481位点)和mlkl(126、520、543位点)的慢病毒质粒。将构建成功的慢病毒质粒转染293T细胞,72 h收取细胞上清液,用其感染PPTCs 48 h后用含10μg/m L嘌呤霉素的M199培养基进行筛选,筛选得到在嘌呤霉素中可以稳定传5代的阳性细胞,western blotting鉴定结果显示,分别靶向于zbp1基因403位点、caspase8基因219位点、rip3基因481位点、mlkl基因126位点的PPTCs基因敲除细胞检测不到相应目的蛋白表达,测序结果显示,在靶位点附近出现碱基缺失,将基因敲除成功的细胞株分别命名为403PPTCs~(zbp1-/-)、219PPTCs~(caspase8-/-)、481PPTCs~(rip3-/-)、126PPTCs~(mlkl-/-)。3.PPV通过ZBP1-RIP3-MLKL途径介导PPTCs发生程序性坏死用细胞凋亡抑制剂Ac-DEVD-CHO预处理1 h后,以1 MOI PPV分别感染野生型PPTCs、403PPTCs~(zbp1-/-)、219PPTCs~(caspase8-/-)、481PPTCs~(rip3-/-)和126PPTCs~(mlkl-/-),LDH释放量测定结果显示,PPV感染24 h时,4种基因缺失株细胞的LDH释放量与野生型细胞差异不显著(P>0.05);感染48 h和72 h时,403PPTCs~(zbp1-/-)、481PPTCs~(rip3-/-)、126PPTCs~(mlkl-/-)的LDH释放量极显著降低(P<0.01),219PPTCs~(caspase8-/-)的LDH释放量差异不显著(P>0.05)。分别检测这些细胞中ZBP1、RIP3、Caspase8与p-MLKL的结果显示,在zbp1缺失的细胞中,PPV感染24 h、48 h和72 h与感染0 h相比,RIP3、Caspase8与p-MLKL表达水平差异不显著(P>0.05);在caspase8缺失的细胞中,与PPV感染0h相比,在感染24 h时,ZBP1、RIP3与p-MLKL表达水平显著升高(P<0.05),在感染48 h和72 h时,3种蛋白表达水平极显著升高(P<0.01);在rip3缺失的细胞中,与PPV感染0 h相比,在感染24 h、48 h和72 h时,Caspase8和p-MLKL表达水平差异不显著(P>0.05),在感染24 h时,ZBP1表达水平显著升高(P<0.05),在感染48Indian traditional medicineh和72 h时,ZBP1表达水平极显著升高(P<0.01);在mlkl缺失的细胞中,与PPV感染0 h相比,在感染24 h的ZBP1和RIP3表达水平均显著升高(P<0.05),在感染48 h和72 h时,ZBP1和RIP3表达水平均极显著升高(P<0.01),而Caspase8表达水平差异不显著(P>0.05)。本研究发现PPV感染可以诱导PPTCs发生程序性坏死,并成功构建403PPTCs~(zbp1-/-)、219PPTCs~(caspase8-/-)、481PPTCs~(rip3-/-)、126PPTCs~(mlkl-/-)细胞株,进一步研究发现,PPV是通过ZBP1-RIP3-MLKL途径诱导PPTCs发生程序性坏死。研究结果为进一步阐明PPV致病机制提供了理论依据。