杂草危害农作物的正常生长,与农作物争夺水分、养分、光和空间,会给农业造成巨大的经济损失。如今杂草对除草剂抗性问题日益严重,杂草抗性治理与新型除草剂靶点的开发刻不容缓。转酮醇酶广泛存在于各种动物、植物、微生物之中,该酶在戊糖磷酸化循环以及光合成的还原型戊糖磷酸循环中起着重要作用,参与植物光合作用的卡尔文循环,作为植物最大光合速率的限制因子,对植物生长发育起着重要调控作用,且在该通路中具有不可替代性,因而是潜在的除草剂作用靶标。狗尾草是一种危害严重的禾本科杂草,广泛分布于中国各地的玉米田及其他农田,对除草剂烟嘧磺隆等药剂的抗性已广泛存在,以狗尾草为实验对象High Medication Regimen Complexity Index研究新型除草剂靶点具有深远的意义和前景。1.本文通过狗尾草叶片提取狗尾草总RNA,再通过反转录试剂盒合成得到狗尾草cDNA,设计特异性引物,扩增得到狗尾草转酮醇酶(TKL)基因。通过构建原核表达载体,并筛选诱导条件,发现狗尾草转酮醇酶蛋白的最佳诱导条件为16℃低温Empagliflozin分子量诱导16 h时蛋白表达量最多;纯化蛋白中,通过咪唑浓度梯度洗脱可知,最佳洗脱浓度为300 mM咪唑的缓冲液。2.狗尾草转酮醇酶与药剂互作研究:基于pH-based转酮醇酶活性测定方法,构建了一种高通量筛选潜在转酮醇酶抑制剂的方法,将原核表达的转酮醇酶蛋白与不同药剂进行孵育,之后再进行酶活测定,通过吸光度的变化定量分析转酮醇酶比活力,从而筛选出对转酮醇酶有特异性抑制的药剂,并通过荧光定量扩增实验验证筛选结果。3.狗尾草转酮醇酶突变蛋白与药剂互作研究:基于实验前期研究基础,选定了5个AY-22989与酶活力相关联的关键氨基酸,构建了5种点突变(皆突变为丙氨酸)的转酮醇酶表达载体,表达、纯化获得蛋白并进行酶活测定,通过与文献中报道的转酮醇酶抑制剂对羟基苯丙酮酸(HPP)孵育后酶活测定结果进行比对,将5种关键氨基酸对酶活力影响强度进行排序:H139A>H376A>H179A>H587A>S497A。4.构建了狗尾草转酮醇酶转基因载体、拟南芥转酮醇酶转基因载体、拟南芥转酮醇酶基因敲除载体,并将拟南芥转酮醇酶基因敲除载体进行应用,通过农杆菌侵染拟南芥花序的方法,经潮霉素平板筛选获得获得T1代阳性苗20余株,为后续获得纯合基因敲除株打下基础。