灵芝多糖是灵芝发酵中的次级代谢产物,它具有免疫调节,抗神经病变,抗肿瘤等多种生物活性。目前灵芝多糖合成途并未完全解析,其中涉及的酶数量众多且特性不明。本课题在灵芝糖供体合成途径基础上,对其中作为相关酶的UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD)进行解析,研究其性质等特点,旨在完善食药用真菌及灵芝UGD的酶学信息并为之后的应用提供参考。主要研究内容及结Liproxstatin-1果如下:(1)首先利用CRISPR/Cas9技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)中的ugd基因,通过分别在敲除位点的上下游(各500 bp)设计引物进行PCR鉴定,仅得到与同源臂总大小(1000 bp)一致的核酸条带,证明目的片段已从基因组上敲除。之后克隆得到灵芝CGMCC5.26菌株编码UGD的基因片段,导入敲除了ugd的E.coil BL21(DE3)中进行异源表达和分离纯化,灵芝UGD纯酶的比酶活为3.6 U·mg~(-1)。(2)对上述构建好的菌株进行发酵优化,得到最适发酵条件:初始p H为7,在生长2 h时添加IPTG,并使其终浓度为0.5 mmol·L~(-1),在转速200 r·min~(-1),温度16℃下诱导24 h,大肠杆菌表达异源UGD的总酶活相比原始条件最终提高了25.4%。(3)对灵芝UGD进行酶学性质分析。酶学性质研究表明最适反应p H点击此处为9,p H为6-8时具有较高的稳定性;最适反应温度为30℃,大于等于35℃时,UGD会快速失活;0.5 mmol·L~(-1)的Mg~(2+)、Ca~(2+)对灵芝UGD活性有着明显促进作用,Cu~(2+)、Zn~(2+)、Ba~(2+)、Ni~(2+)在高浓度时会抑制酶活力,表面活性剂SDS对灵芝UGD有着明显抑制作用;其K_m值为0.14 mmol·L~(-1),反应最大速率V_(max)为1428.6μmol·min~(-1)·L~(-1),催化常数k_(cat)为2.5 s~(-1),与底物亲和力高于大多数细菌,低于大部分植物。(4)将灵芝UGD的310位Met和144位Met同时突变为Cys和Leu,UGD的比酶infectious bronchitis活提高了55.2%,达到了5.6 U·mg~(-1)。突变体的最适反应温度为30℃,当温度大于20℃小于40℃时,突变体放置一小时后的剩余酶活均在80%以上,并且在45℃的环境下放置一小时后的剩余酶活达到了43.4%。突变体的K_m为0.12 mmol·L~(-1),最大反应速率V_(max)为1724μmol·min~(-1)·L~(-1)。对比野生型,突变体的K_m值下降了,说明其与底物的亲和能力增加了。通过分子动力学模拟发现组合突变体具有一个相对稳定的状态,RMSD整体低于野生型,维持在1.5?左右。组合突变体和野生型的催化反应均在反应时间为12 h时达到平衡,UDP-葡萄糖醛酸的转化率分别为58.4%和38.7%。(5)为提高酶的稳定性和催化效率,用壳聚糖为载体进行UGD的固定化,固定化的最佳条件为:戊二醛交联壳聚糖载体的浓度为0.5%、交联时间为1 h,载体吸附纯酶的时间为12 h,在该条件下固定化效率为19.9%,酶活回收率为7.3%,比酶活则达到了1.3 U·mg~(-1)。固定化UGD的最适反应温度为30℃,并且在40℃下放置一小时后的剩余酶活为70.2%,相比游离酶固定化UGD具有更高的稳定性,并且可提高UGD在碱性环境中的稳定性。在最佳条件下进行固定化,测得固定化突变酶的效率为26.8%,酶活回收率为11.8%,比酶活则为1.8 U·mg~(-1)。