研究背景:心力衰竭是由心脏收缩功能或舒张功能障碍引起的,是各种恶性心脏疾病的终末阶段,在心力衰竭发展过程中,常伴随有心肌肥大、心肌纤维化、线粒体功能障碍和线粒体自噬异常等病理变化。线粒体是决定心肌细胞存活或死亡最重要的细胞器,线粒体的形态功能改变,诱导氧化应激并引起线粒体稳态失衡。研究目的:本文旨在通过在体实验和离体实验探究Ndufb10在8周游泳运动调控线粒体稳态改善病理性心肌肥大中的作用与机制,为治疗病理性心肌肥大提供metal biosensor新的思路。研究方法:在体实验:1.42只SPF级雌性7周龄SD大鼠,随机分为安静对照组(CN,n=8),假手术组(SHAM,n=8),手术组(SC,n=12),手术运动组(SE,n=14);SC组大鼠经腹主动脉缩窄术(TAC)建立病理性心肌肥大模型,SHAM组大鼠开胸不结扎;SE组大鼠TAC术后进行8周游泳运动干预。2.超声心动图检查各组大鼠心脏形态和功能。3.称量各组大鼠左心室重量、全心重量和体重,计算全心质量指数、左心质量指数等指标。4.采用HE、Masson和TUNEL染色观察各组大鼠心肌形态、纤维化及凋亡情况。5.采用透射电镜观察各组大鼠心肌超微结构、线粒体形态和自噬情况。6.RT-qPCR检测各组大鼠病理性心肌肥大标志物、自噬和凋亡相关标志物mRNA的表达水平。7.Western blotting检测各组大鼠自噬、凋亡和线粒体动力相关蛋白表达水平。8.采用RNA-seq测序分析SC组和SE组全转录组差异基因。离体实验:1.细胞分组设置为空白组(AngⅡ 0h组,n=6)、模型组(AngⅡ干预48h,n=6)、敲低对照组(shContorl+AngⅡ干预 48h 组,n=6)、敲低组(shNdufb10+AngⅡ干预 48h组,n=6)共四组。2.采用JC-1法检测各组细胞线粒体膜电位程度,钙黄绿素乙酰甲酯荧光探针法检测各组细胞MPTP开放程度,DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞ROS水平,比色法检测各组细胞NADH水平。3.TUNEL染色法观测各组细胞凋亡情况。4.Western blotting检测各组细胞自噬、凋亡及线粒体动力相关蛋白的表达。研究结果:在体实验:1.病理性心肌肥大相关指标:与CN和SHAM组相比,SC组的HW/BW和LV/BW显著增加(P<0.05),LVPWd、LVPWs、LVIDd、LVIDs 显著上升(P<0.05),SC组大鼠左心室发生肥厚;EF、FS显著下降(P<0.05),SC组大鼠心功能下降。心肌细胞直径显著增大(P<0.05),心肌胶原纤维容积百分比(CVF%)显著上升(P<0.05),病理性标志物(ANP、BNP、β-MHC)mRNA表达显著升高(P<0.05);与SC 组相比,SE 组 LV/BW 显著降低(P<0.05),LVSd、LVPWd、LVPWs、LVIDd、LVIDs显著降低(P<0.05),EF、FS显著增加(P<0.05),心肌细胞直径显著减小(P<0.05),心肌胶原纤维容积百分比(CVF%)显著降低(P<0.05),病理性标志物(ANP、BNP、β-MHC)mRNA表达显著降低(P<0.05)。2.透射电镜结果:CN组和SHAM组心肌纤维及线粒体排列整齐,线粒体形态完好;SC组心肌组织肌原纤维溶解,横管压缩变形,线粒体排列紊乱,线粒体变大,同时可观察到严重的线粒体水肿和明显的空泡化,线粒体嵴结果损伤出现裂变,自噬溶酶体包浆成分已出现降解,凋亡小体增加;与SC组相比,SE组线粒体裂变减少,嵴结构相对规则,水肿及空泡化现象及凋亡小体减少,未发现降解的自噬溶酶体。3.凋亡相关指标:与CN组相比,SHAM组凋亡相关指标无显著性变化(p>0.05);与CN组和SHAM组相比,SC组大鼠心肌细胞凋亡情况明显增加(P<0.05),bax/bcl-2比值显著上调(P<0.05),Bax蛋白GSK J4表达显著上调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达显著下调(P<0.05),线粒体凋亡相关的Caspase3、Caspase9 mRNA表达显著升高(P<0.05),Caspase3、Caspase9、Cytochrome C 蛋白表达明显升高(P<0.05);与SC组相比,SE组大鼠心肌细胞凋亡率显著减少(P<0.05),bax/bcl-2比值显著下调(P<0.05),Bax蛋白表达显著下调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达显著上调(P<0.05),线粒体凋亡相关的Caspase3、Caspase9 mRNA表达显著降低(P<0.05)Caspase3、Caspase9、Cytochrome C 蛋白表达显著降低(P<0.05)。4.自噬相关基因与蛋白:与CN组相比,SHAM组自噬相关基因与蛋白表达无显著变化(p>0.05);与CN和SHAM组相比,SC组P62和LC3的基因与蛋白表达显著上调(p<0.05),线粒体自噬相关NIX和BNIP3基因与蛋白显著上调(p<0.05);与SC组相比,SE组P62和LC3的基因与蛋白表达显著下调(p<0.05),线粒体自噬相关NIX和BNIP3基因与蛋白显著下调(p<0.05)。5.线粒体动力相关蛋白:与CN组相比,SHAM组线粒体融合蛋白(MFN1、OPA1)和线粒体分裂蛋白(DRP1、FIS1)表达无显著性变化(p>0.05);与CN和SHAM组相比,SC组线粒体融合蛋白MFN1和OPA1蛋白表达显著下调(p<0.05),线粒体分裂蛋白DRP1和FIS1蛋白表达显著升高(p<0.05);与SC组相比,SE组大鼠线粒体融合蛋白MFN1和OPA1蛋白表达显著上调(p<0.05),线粒体分裂蛋白DRP1和FIS1蛋白表达显著降低(p<0.05)。6.RNA-seq测序后,分析筛选出Ndufb10这一关键基因。离体实验:1.AngⅡ体外模拟心肌细胞病理性肥大模型:AngⅡ 48h刺激的H9C2细胞,病理性心肌肥大标志物ANP和BNP mRNA表达显著升高(P<0.05),细胞直径显著增大(P<0.01)。2.敲低Ndufb10腺病毒转染H9C2心肌细胞:敲低H9C2心肌细胞中Ndufb10基因的表达,腺病毒转染24h后,Ndufb10的mRNA表达显著降低(P<0.05)。3.病理标志基因:与 AngⅡ 0h 组相比,AngⅡ48h 组和 shControl+AngⅡ48h 组 BNP mRNA 表达显著增高(P<0.05),与 AngⅡ 48h 组和 shControl+AngⅡ 48h 组相比,shNdufb10+AngⅡ 481h组BNP mRNA表达显著增高(P<0.05)。4.线粒体功能相关指标:与AngⅡ 0h相比,AngⅡ 48h组和shControl+AngⅡ 48h组细胞NADH水平显著降低,ROS显著增加,线粒体膜电位显著下降,MPTP开放程度显著增高(P<0.05);与 AngⅡ 48h 组和 shControl+AngⅡ 48h 组相比,shNdufb10+AngⅡ 48h组NADH水平显著降低,ROS的产生显著增加,线粒体膜电位显著下降,MPTP开放程度显著增高(P<0.05)。5.线粒体动力相关蛋白:与AngⅡ 0h组相比,AngⅡ 48h组和shControl+AngⅡ 48h组线粒体融合蛋白MFN1和OPA1表达显著下降(P<0.01),线粒体分裂蛋白DRP1和FIS1蛋白表达显著升高(P<0.01);与AngⅡ48h组和shControl+AngⅡ 48h组相比,shNdufb10+AngⅡ 48h组线粒体融合蛋白OPA1表达显著降低(P<0.01),线粒体分裂蛋白DRP1和FIS1表达显著上升(P<0.01)。6.自噬相关蛋白:与AngⅡ 0h组相比,AngⅡ 48h组和shControl+AngⅡ 48h组的P62、NIX 和 BNIP3 蛋白表达显著增加(P<0.01);与 AngⅡ 48h 组和 shControl+AngⅡ48h组相比,shNdufb10+AngⅡ 48h组P62、NIX和BNIP3 蛋白表达显著上调(P<0.01)。7.凋亡相关指标:与AngⅡ 0h组相比,AngⅡ 48h组和shControl+AngⅡ 48h组细胞凋亡显著增加(P<0.01),促凋亡蛋白bax显著Protein Tyrosine Kinase抑制剂上调(P<0.05),抗凋亡蛋白bcl-2显著降低(P<0.05),线粒体凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase9、Cytochrome C表达显著升高(P<0.01);与 AngⅡ 48h 组和 shControl+AngⅡ 48h 组相比,shNdufb10+AngⅡ48h组细胞凋亡显著增加(P<0.01),促凋亡蛋白bax显著上调(P<0.05),抗凋亡蛋白bcl-2明显降低(P<0.05),线粒体凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase9、Cytochrome C 表达显著升高(P<0.01)。研究结论:1.8周游泳运动有效改善TAC手术诱导的病理性心肌肥大。2.RNA-seq测序后,KEGG富集分析发现差异基因显著富集在氧化磷酸化通路,进一步分析后筛选出显著变化的关键基因Ndufb10,且后期RT-qPCR和Western-blot验证结果与测序结果相符。3.8周游泳运动通过激活Ndufb10的表达,增强线粒体的功能,抑制线粒体发生过度自噬与过度凋亡,维持线粒体稳态,继而发挥改善病理性心肌肥大的重要作用。