根系是植物吸收养分和水分的主要器官,其发育是植物生长过程中的一个重要过程。根系的功能包括从土壤中吸收养分和水分,在土壤中扎根以防止倒伏,同时也是植物与土壤环境中各种生物和非生物因素之间的主要受体界面,作物根系发育情况最终决定产量。因此,寻找水稻根系发育调控基因并验证其功能一直是水稻育种工作者关注的重点之一。生长素在植物根系发育过程中发挥着诱导和调节的作用,其信号调控通路与泛素化途径有显著关联。泛素化途径主要参与激素信号转导、开花发育、光形态建成等生物学过程。泛素结合酶是植物泛素化过程重要组成部分,其功能主要是募集下游E3泛素连接酶,并与之组成复合体,拉近泛素分子与底物蛋白距离,并使靶蛋白被标记,最后完成泛素化过程,其中SCF~(TIR1) E3泛素复合体对生长素信号阻遏蛋白AUX/IAA起降解作用,最终解体AXU/IAA-ARF异二聚体,释放ARF,激活生长素调控信号。可以得知泛素化途径与生长素之间的调控关系研究目前已经较为透彻,但泛素结合酶与根系发育之间关系目前报道较少。本研究通过大规模筛选T-DNA插入突变体库,发现一个短根突变体R164,通过Self-formed adaptor PCR(SEFA-PCR)并测序比对鉴定出T-DNA上串联4个35S增强元件插入在一个泛素结合酶OsUBC11基因启动子区,从而激活了该基因的转录,进一步研究发现其参与生长素途径,并影响了其它根系发育基因表达来调控根的发育。结果如下:1.OsUBC11蛋白存在保守UBC结构域,是泛素结合酶关键组分,在水稻中存在一个同源基因Os UBC12,拟南芥中存在3个同源基因,分别是At UBC7、At UBC13和At UBC14,但这些同源基因具体功能未见报道。2.组织表达分析,发现OsUBC11主要在根中表达量最高;同时通过构建OsUBC11启动子融合GUS稳定的转基因株系染色,发现OsUBC11在水稻根部表达量最高,说明OsUBC11是一个调控根部发育关键基因;3.通过构建OsUBC11-GFP亚细胞定位重组载体并转入水稻原生质体中发现OsUBC11是核定位基因,其主要在细胞核中发挥作用;4.泛素结合酶主要通过其保守半胱氨酸位点结合泛素分子并完成其泛素化功能,本试验通过点突变方法及原核表达手段获得OsUBC11-His及突变重组蛋白。Western blot结果显示,改变其保守半胱氨酸位点会使其丧失泛素化活性,说明OsUBC11具有泛素结合酶活性,同时突变泛素分子进行多聚泛素化形式的48位赖氨酸,也可使OsUBC11无法形成泛素级联链,说明OsUBC11以K48多聚泛素化途径降解下游靶蛋白方式完成其泛素化过程;5.通过对过表达OsUBC11的株系表型分析验证过表达OsUBC11会抑制水稻主根及侧根发育,类似激活突变体R164表型;通过外源生长素处理可部分恢复表型;测定其根部生长素浓度发现其过表达株系及激活突变体R164生长素含量显著降低;这些结果说明OsUBC11过表达会减少根部生长素积累,进而抑制根部发育,从而表明OsUBC11参与了生长素途径来调控根的发育;6.实时荧光定量方法验证发现OsUBC11过表达会抑制生长素合成基因(家族)Os TAA1、Os YUCinfant immunizationCA4、Os YUCCA6和Os YUCCA9,生长素细胞内转运selleck BLZ945调控基因Os AUX1和Os AUX4,及生长素信号调控因子Os IAA31、Os ARF16和Os ARF25等转录表达,说明OsUBC11可以通过生长素合成、转运或调控生长素调节因子转录表达水平进而调控水稻根部发育;此外,在浓度1μM萘乙酸水培瞬时处理下,可以明显到看到OsUBC11转录表达水平受到抑制,GUS染色结果与转录水平测定结果吻合,从而说明高浓度的生长素可能会反馈抑制OsUBC11的表达;进一步证实了OsUBC11与生长素相互关系。7.进一步,我们在OsUBC11过表达的株系中检测了已经报道的和根发育相关基因Os CRL1、Os CRL4、Os CRL5、Os CKX4及Os WOX11的转录水平,发现它们的转录水平在OsUBC11过表达株系中显著下调。从而说明OsUBC11影响或者协同其他根发育关键基因来控制水稻根的发育。8.此外,我们发现过表达或者激活OsUBC11除了调控根的发育,还会通过影响及最上节间长度使其株高显著降低,还会使可育花粉含量变少、结实性率下降等多种表型,最终会使产量降低。以上结果表明OsULBH589BC11是一种保守的泛素结合酶,其参与了生长素途径来调控水稻幼苗根系发育,同时还会影响其株高及结实率,进而对水稻产量产生显著影响。