猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)作为重要的人畜共患病原菌,在世界范围内广泛流行,其可导致猪脑膜炎、败血症和关节炎等多种严重疾病,是导致保育仔猪高死亡率和高淘汰率的重要原因。此外,猪链球菌不仅会给养猪业带来巨大的经济损失,还会通过被污染的环境或饮食等途径传播给人类,严重威胁人类健康。在兽医临床上,常用磺胺类药物治疗细菌性脑膜炎,其中磺胺嘧啶钠在脑脊液的浓度最高,对细菌性脑膜炎治疗效果更好。然而,随着磺胺类药物的大量使用,猪链球菌对磺胺类药物的耐药性www.selleck.cn/products/forskolin日趋严重。因此,需要研究新的治疗策略以解决磺胺类药物耐药性问题。最近研究表明,抗菌增效剂不仅能延长传统抗菌药物的使用寿命,还具有价格低廉和安全性高等优点。因此,抗菌增效剂策略已成为预防细菌耐药性发展或逆转/消减细菌耐药性的策略之一。此外,针对动物源细菌耐药问题,农业农村部近年来开展了抗菌药物减量化行动和发布了194号公告,明确规定了退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种,为中药在兽医临床“减抗”的基础研究及研发提供了机遇。因此,从猪链球菌病的流行趋势和我国政策出发,研发以中药为主体的抗菌增效剂,在临床猪链球菌病的防治中具有重要意义。在本研究中,我们首先通过体外联合药敏试验,从87种药食同源中药的化学成分中筛选出30种中药单体化合物,发现没食子酸可以增强磺胺类药物对猪链球菌的敏感性。其次,构建大蜡螟感染模型和小鼠脑膜炎模型,初步探讨没食子酸联合磺胺嘧啶钠的体内治疗作用;此外,选择临床患有慢性猪链球菌病的保育仔猪进行治疗,评估没食子酸联合磺胺嘧啶钠的临床疗效;最后,基于没食子酸的抗菌特点,阐明没食子酸联合磺胺类药物对猪链球菌的抗菌机制。具体研究结果如下:(1)猪链球菌磺胺类药物抗菌增效剂的筛选与验证以猪链球菌磺胺嘧啶钠耐药菌株为研究对象,通过微量肉汤稀释法和棋盘法测定30种中药单体与磺胺类药物对其最小抑菌浓度(MIC)和分级抑菌浓度指数(FICI),结果显示:中药单体化合物对猪链球菌的MIC值范围为11～1280μg/m L,磺胺嘧啶钠、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶以及磺胺异噁唑对猪链球菌的MIC均值大于640μg/m L,其中没食子酸和磺胺嘧啶钠对猪链球菌的MIC值分别为320μg/m L和1280μg/m L;此外,没食子酸与磺胺嘧啶钠联合后,磺胺嘧啶钠对猪链球菌的MIC值从1280μg/m L降低至160μg/m L,由耐药恢复为敏感水平,其FICI为0.25,呈协同作用;同时,没食子酸与磺胺嘧啶钠联合应用后对87.1%(27/31)的临床耐药猪链球菌有协同或相加抗菌作用,完全逆转磺胺嘧啶钠耐药性的比例占70%。另外,经过连续21天的没食子酸联合磺胺嘧啶钠体外强诱导压力下,猪链球菌对磺胺嘧啶钠仍旧敏感,表明两者联合应用,猪链球菌对磺胺嘧啶钠不易产生耐药性。(2)没食子酸联合磺胺嘧啶钠对猪链球菌感染模型的治疗作用利用大蜡螟存活率模型和小鼠脑膜炎模型,评估没食子酸联合磺胺嘧啶钠对猪链球菌感染的治疗作用,结果发现:没食子酸联合磺胺嘧啶钠治疗后,大蜡螟的存活率为70%,显著高于单独药物治疗组(p<0.01);同时,没食子酸和AG-221磺胺嘧啶钠联合治疗可以显著降低小鼠血浆中炎性细胞因子的含量,降低各个脏器猪链球菌的菌落数,有效地减轻了脑部组织的炎症性损伤(p<0.01)。(3)没食子酸联合磺胺嘧啶钠的临床疗效评价以临床患有慢性猪链球菌病的保育仔猪为研究对象,评估没食子酸联合磺胺嘧啶钠的临床疗效,结果表明:没食子酸联合磺胺嘧啶钠可有效county genetics clinic改善因猪链球菌感染引起的相关临床症状,治疗由猪磺胺类耐药猪链球菌引起的猪链球菌病(p<0.01)。(4)没食子酸破坏猪链球菌细胞膜的完整性发挥协同抗菌作用利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察的方法分析没食子酸与磺胺嘧啶钠联合应用对猪链球菌超微结构的影响,结果显示:没食子酸联合磺胺嘧啶钠处理的细菌表面表现为严重受损。随后,通过测定胞外DNA含量和PI染色评估没食子酸对猪链球菌细胞膜完整性的影响,结果显示没食子酸联合磺胺嘧啶钠处理,可以显著破坏猪链球菌的细胞膜完整性(p<0.01)。(5)没食子酸影响猪链球菌的细胞膜功能发挥协同抗菌作用通过测定细胞膜流动性、质子驱动力(PMF)和胞内活性氧(ROS)含量和细菌细胞内磺胺嘧啶钠积累量,探究没食子酸对猪链球菌细胞膜功能的影响。结果显示:没食子酸虽然不能抑制外排泵功能,增加胞内磺胺嘧啶钠的积累量,但没食子酸联合磺胺嘧啶钠可以显著降低猪链球菌的细胞膜流动性、耗散细胞膜的PMF以及诱导细菌细胞内产生过量的ROS发挥联合抗菌作用(p<0.01)。(6)没食子酸靶向二氢叶酸还原酶(DHFR)发挥联合抗菌作用利用分子对接技术和生物膜层干涉技术(BLI)印证没食子酸与DHFR的直接结合作用,结果表明:没食子酸与DHFR以剂量依赖性方式直接结合并抑制DHFR活性(p<0.01),两者的亲和解离常数为5.96×10~(-4) M;同时使用分子动力学模拟、氨基酸定点突变技术、BLI和酶活性分析证明Arg61是没食子酸与DHFR相互作用的关键氨基酸。(7)没食子酸调控叶酸代谢途径发挥联合抗菌作用利用RT-PCR、Western blot以及叶酸代谢途径中代谢物含量的测定揭示没食子酸对叶酸代谢途径的调控作用,结果发现:没食子酸联合磺胺嘧啶钠能够通过显著下调cys M、fol A、lux S、mtn N和met K的转录和翻译而影响四氢叶酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和S-核糖同型半胱氨酸的含量发挥联合抗菌作用(p<0.01)。综上所述,本研究证实了没食子酸与磺胺类药物联合应用后,在体外和体内均能有效抑制耐药猪链球菌的生长;同时,临床试验证明了没食子酸可以增强磺胺嘧啶钠对患有猪链球菌病保育仔猪的治疗效果;此外,机制研究发现没食子酸除了可以破坏猪链球菌细胞膜的完整性、影响细胞膜的功能外,还能靶向DHFR,影响四氢叶酸的合成和利用而发挥协同抗菌作用。因此,没食子酸可以作为有效的磺胺类药物增效剂,用于临床治疗猪链球菌感染性疾病。