种质资源是作物育种的原始材料,作物基因功能的挖掘和利用优异基因创制新品种,对丰富种质资源,进而推动作物育种发展具有重要意义。本研究我们一方面从N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)化学诱变的粳稻品种农院238突变体库中鉴定到一个新的幼苗白化致死突变体,命名为albino seedling lethality 4(asl4),利用图位克隆技术分离控制该性状的基因,通过分子生物学相关试验对基因功能进行解析;另一方面,利用基因编辑技术敲除籼型两系杂交稻徽两优858(HLY858)的亲本1892S和M858的Wx和BADH2/FGR基因,获得T-DNA-free的纯合编辑系,以纯合编辑系为亲本进行杂交配组获得香糯两系杂交稻,对目标性状、主要农艺性状和稻米品质相关指标进行分析,评估了其育种应用价值。通过对水稻种质资源的挖掘和创制,得到如下结果:1.水稻叶绿体发育基因ASL4的克隆和功能分析:(1)突变体asl4表现为幼苗白化,三叶期后逐渐死亡。突变体asl4中几乎检测不到叶绿素和类胡萝卜素,叶片中合成光合色素的细胞数目显著减少。透射电镜观察发现,突变体asl4中叶绿体发育异常。(2)遗传分析表明突变体asl4白化表型受由单隐性核基因控制。利用图位克隆技术将目的基因定位在水稻第3号染色体短臂K40和K29两个标记之间约50 Kb的物理区间内,该区间有3个开放读码框(Open reading frame,ORF)。对3个ORFs测序分析,发现突变体asl4中ORF3(LOC＿Os03g20100)存在2855 bp缺失,导致ORF3蛋白翻译提前终止,因此将ORF3作为候选基因。(3)互补试验证实LOC＿Os03g20100即为调控水稻白化致死表型的目的基因,命名为ASL4。ASL4编码叶绿体核糖体小亚基蛋白PRPS1,靶向叶绿体,该蛋白含有一个RNA绑定结构域,同源比对分析表明该结构域在其他光合生物中十分保守,进化分析结果显示ASL4最初可能由苔藓进化而来。(4)表达预测结果显示ASL4在水稻各组织中均有表达,尤其在叶和叶鞘中表达较高。定量PCR分析表明,ASL4在水稻叶片发育早期的第四叶和新展开叶中高度表达,说明ASL4参与叶绿体的生物合成,对水稻幼苗叶片早期发育十分重要。光诱导试验表明ASL4是一个光诱导表达基因。(5)叶绿体发育相关基因表达分析显示,突变体asl4中依赖于质体编码的RNA聚合酶(The plastid-encAZD6738细胞培养oded RNA polymerase,PEP)转录的光合作用相关基因表达显著下调,依赖于核编码的质体RNA聚合酶(The nuclear-encoded plastid RNA polymerase,NEP)转录的持家基因表达显著上调,说明突变体质体PEP的转录活性受损。突变体asl4叶绿素生物合成相关基因表达与野生型相比亦显著下调,表明突变体asl4中叶绿素合成出现异常。(6)转录组分析与定量结果一致,突变体asl4中大部分质体编码的基因表达Hospital acquired infection显著下调。Western blot分析显示突变体asl4中大多数质体基因编码的蛋白和核基因编码蛋白含量显著下降,说明asl4突变后阻碍了质体编码蛋白的合成,并通过“逆行信号”影响核基因编码蛋白的表达。(7)对叶绿体核糖体组分检测发现,突变体asl4中叶绿体核糖体16S和23S r RNAs和相关核糖体蛋白含量下降,可能导致叶绿体核糖体正常功能受损,从而影响质体蛋白的翻译。2.香糯水稻资源的创制:(1)水稻光温敏核不育系1892S和恢复系M858的Wx和BADH2/FGR基因均为Wx~b型的非香型水稻。利用CRISPR/Cas9系统同时敲除1892S和M858的Wx和BADH2基因,获得四个T-DNA free的纯合编辑系,分别为1892S~(wxfgr)-1、1892S~(wxfgr)-2、M858~(wxfgr)-1和M858~(wxfgr)-2。四个纯合编辑系在Wx和BADH2上均为移码突变,导致翻译提前终止,基因功能丧失。(2)四个纯合编辑系的胚乳不透明,0.02%的I_2-KI染色使籽粒均呈现紫红色,而野生型胚乳为深蓝色。扫描电镜分析发现,与野生型相比,纯合编辑系胚乳中淀粉粒内部孔隙变大数目增多。1.7%KOH浸泡和人工咀嚼纯合编辑系籽粒都感受到明显的香味,而野生型无香味。(3)纯合编辑系的主要农艺性状、稻米加工品质、粒长、粒宽以及长宽比与野生型相比差异不显著。纯合编辑系表观直链淀粉含量(Apparent amylose content,AAC)下降到4.5-5.6%,胶稠度(Gel consistency,GC)显著升高,尺寸排阻色谱法(Size-exclusion chromatography,SEC)测定淀粉分子量分布结果表明,四个纯合编辑系的直链淀粉含量(Amylose content,AC)为0.22-1.63%,均达到糯米水平。淀粉热力学测定结果表明,纯合编辑系的稻米糊化温度(Gelatinization temperature,GT)与相应野生型相比无显著差异。快速粘度分析(Rapid viscosity analyzer,RVA)显示直链淀粉含量下降改变了纯合编辑系米粉的峰值时间,同时降低了冷胶粘度和崩解值。(4)利用纯合编辑系杂交Pidnarulex化学结构构建了杂交稻株系HLY858~(wxfgr)-1、HLY858~(wxfgr)-2。HLY858~(wxfgr)-1和HLY858~(wxfgr)-2胚乳外观与纯合编辑系亲本相似的糯稻类型。利用HS-SPME/GC-MS测定2AP含量显示,HLY858~(wxfgr)-1和HLY858~(wxfgr)-2的精米中2AP含量分别为153.0μg/kg和151.0μg/kg,而野生型HLY858中未检测到2AP峰。HLY858~(wxfgr)-1和HLY858~(wxfgr)-2与野生型HLY858相比,主要产量性状、稻米加工品质、粒长、粒宽以及长宽比无显著差异。HLY858~(wxfgr)-1和HLY858~(wxfgr)-2具有与纯合编辑系亲本相似的稻米理化特性。结果表明通过编辑不育系和恢复系的Wx和BADH2基因我们创制了新型香糯两系杂交稻。