无核性状是柑橘育种重要目标之一,在促进我国柑橘产业发展和提高柑橘市场竞争力方面发挥着不可替代的作用。目前对于柑橘无核性状形成的调控机制缺乏足够的理解,因此解析柑橘无核成因的内在分子机理和挖掘相关基因资源具有重要的理论和实际意义。本研究以有核椪柑‘鄂柑1号’(Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan)和椪柑无核芽变‘华柑4号’(C.reticulata Blanco cv.Ponkan)为材料,基于细胞学观察、转录组测序、遗传转化以及生理生化数据测定等研究了柑橘种子败育的内在分子机理。主要研究结果如下:1.‘华柑4号’种子败育关键时期鉴定为了鉴定‘华柑4号’种子败育发生的关键时期,本研究通过石蜡切片和形态学统计分析了‘华柑4号’和‘鄂柑1号’授粉后的种子发育状态。‘华柑4号’和‘鄂柑1号’种子大小在18 day after pollination(DAP)到28 DAP没有显著差异,但是‘华柑4号’种子在32 DAP和36 DAP呈现萎缩失活的状态,而‘鄂柑1号’种子则在该阶段逐渐发育膨大。结果表明28 DAP到32 DAP是‘华柑4号’种子败育的关键时期。2.‘华柑4号’和‘鄂柑1号’种子早期发育转录组测序及比较分析基于‘华柑4号’种子败育关键时期的鉴定结果,本研究利用激光显微切割技术精确获取了‘华柑4号’和‘鄂柑1号’在18 DAP、28 DAP和32 DAP三个发育时期的珠心组织和种皮组织,采取单引物等温扩增方式进行c DNA文库构建和转录组测序。利用单分子实时测序获得的全长转录本作为转录组测序的参考转录本,获得了平均75.80%的比对率。通过表达模式分析、组织特异性表达分析和差异表达分析更多等多维度的数据分析鉴定出一些与种子败育密切联系的生物学过程和代谢通路,包括细胞分裂、营养代谢和植物激素信号转导。3.‘华柑4号’种子败育关键基因和调控网络鉴定针对候选的生物学过程和代谢通路,本研究进一步通过蛋白互作网络和基因表达模式分析鉴定到一些发挥关键功能的基因,包括参与细胞周期调控的细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶、参与丝氨酸合成的关键基因EDA9和参与淀粉合成的关键基因SBE2.1。细胞分裂和营养代谢相关基因在‘华柑4号’种子败育时期均表现出不同程度的下调表达,表明在柑橘种子败育过程中细胞分裂和营养代谢过程受到抑制。不同植物激素水平和相关合成、转运、代谢、信号转导基因在种子发育不同阶段表现出独特的变化模式。例如,反式玉米素水平在‘华柑4号’和‘鄂柑1号’种子的三个发育阶段表现出显著差异,而其它类型的细胞分裂素在种子正常发育的‘鄂柑1号’中均维持较低水平,表明反式玉米素在柑橘种子发育过程中发挥着主导作用。此外,在种子败育时期‘华柑4号’种子脱落酸含量显著高于‘鄂柑1号’种子,并且脱落酸信号转导和响应基因如ABI5、ABF2和HB7在种子败育时期上调表达,揭示了增强的ABA信号与柑橘种子败育之间的潜在联系。基于转录调控分析和共表达网络分析进一步筛选到一些在‘华柑4号’种子败育关键时期异常表达的转录因子如MYB3R4、WRKY74和WRKY48,其中WRKY74和WRKY48在种子败育时期上调表达并且与脱落酸信号响应模块具有密切的相关性。这些结果表明WRKY74和WRKY48可能正向调控柑橘种子败育。4.CrWRKY74和CrWRKY48在种子败育中的功能解析为了进一步解析和验证CrWRKY74和CrWRKY48的生物学功能,本研究构建了CrWRKY74和CrWRKY48的超表达拟南芥株系。超表达Scabiosa comosa Fisch ex Roem et SchultCrWRKY74导致49.78%的种子发生败育,并且败育发生在受精之后和球形胚形成之前。荧光原位杂交、定量PCR和TUNEL实验表征了PCD信号与CrWRKY74表达之间的正相关性。通过DAP-seq和酵母单杂进一步筛选到CrWRKY74与HB7、AHK2和AREB3的互作关系,其中HB7是诱导PCD发生的关键基因,并且与CrWRKY74的表达模式相似。超表达CrWRKY48同样导致45.48%的拟南芥种子发生败育,并且PCD信号显著强于野生型种子。基于DAP-seq和酵母单杂鉴定到CrWRKBI 10773采购Y48与PCD诱导基因SOBIR1的互作关系。这些结果表明CrWRKY74和CrWRKY48通过诱导PCD的异常发生促进柑橘种子败育。综上所述,本研究鉴定了细胞分裂、营养代谢、植物激素以及PCD过程对‘华柑4号’种子败育的潜在调控作用,并初步解析了以CrWRKY74和CrWRKY48为核心基因的种子败育调控网络,这些研究为无核柑橘分子育种提供了新的基因资源和见解。