(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((R)-CHBE)是一种手性有机化合物。它是许多手性药物合成过程中不可或缺的中间体,可通过氯基的还原、置换或其他官能团的导入来合成相关药物。此外,以(R)-CHBE为中间产物合成的手性物质在医药和食品等领域广泛应用。近年来,主要通过手性拆分法和不对称合成法合成(R)-CHBE。手性拆分法由于其底物利用率低Microbiological active zones,产物(R)-CHBE后续纯selleck Rapamycin化步骤繁琐等缺点逐渐被淘汰。而不对称合成法包括化学合成法和生物合成法。化学合成法由于反应条件苛刻、对映选择率不高等缺点也逐渐退出市场。而生物合成法合成(R)-CHBE的反应条件温和,产物对映选择率高而逐渐步入工业生产。此外,由于底物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)和产物(R)-CHBE在碱性条件下或者温度偏高的环境中容易水解。因此,本研究致力于寻找能够在酸性条件下能稳定地合成(R)-CHBE的酶。首先从耐酸性菌株植物乳杆菌DSM 20174(Lactobacillus plantarum DSM 20174)中成功筛选到能够在酸性环境中不对称合成(R)-CHBE的醛酮还原酶(LPAKR5和LPAKR9),然后构建了LPAKR9和葡萄糖脱氢酶(GDH)的共表达系统,实现了NADPH的再生和(R)-CHBE的合成。主要研究结果如下:(1)从实验室保存的菌株中得到酸耐性较好且具有(R)-CHBE合成能力的乳酸菌——L.plantarum DSM 20174。并基于对L.plantarum DSM 20174全基因组的分析预测,成功克隆了14个LPAKRs基因,并将其连接至p RSFDuet-1质粒,然后在E.coli BL21(DE3)中诱导表达。结果发现,只有LPAKR5和LPAKR9能够催化COBE,它们的蛋白质分子量约为31 kDa。(2)利用镍柱和脱盐柱对LPAKR5和LPAKR9进行纯化,然后对酶学性质进行研究。实验结果表明,LPAKR5和LPAKR9的最适p H均为6.0,并且在p H为6.0时,它们能够在12小时内保持较高的稳定性。此外,LPAKR5和LPAKR9的最适温度分别为30℃和40℃,在较低温度下也能保持较高的稳定性。以COBE为底物,对LPAKR5和LPAKR9的动力学参数进行分析,LPAKR5和LPAKR9的K_m值分别为9.5 m M和8.7 m M,V_(max)值分别为7.6 U·mg~(-1)和8.59 U·mg~(-1),k_(cat)/K_m值分别为2.40 L·mmol~(-1)·s~(-1)和1.95 L·mmol~(-1)·s~(-1)。(3)基于LZ-IETD-FMK使用方法PAKR9和Bacillus subtilis ATCC 13952的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因,构建了E.coli BL21(DE3)/p RSFDuet-1-lpakr9-gdh双酶共表达体系,实现NADPH的再生。通过优化全细胞催化COBE合成(R)-CHBE的转化条件,最佳反应条件为:90 m M葡萄糖,20 m M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(p H 6.0),20 g·L~(-1)全细胞催化剂,40 mM COBE,30℃,200 rpm反应4 h,产量最高为25.2 mM。