目的:根皮苷(Phloridzin)是二氢黄酮类化合物根皮素(Phloretin)的2′-β-D-葡萄糖苷,本论文研究目标为使用合成生物学方法在Ferrostatin-1使用方法酵母体内合成根皮苷,为根皮苷的获取提供质量均一、易分离纯化且产量稳定的创新获取方式,为高产根皮苷的酵母细胞工厂构建奠定基础,加速推动其作为药品和保健品的产业化开发利用。方法:本研究以高产对-香豆酸(ρ-HCA)的工程酵母为出发菌株,使用CRIPSR-Cas9技术整合根皮苷上游4CL和CHS基因,考察不同启动子对根皮苷前体根皮素的产量影响。对高产根皮苷的植物木姜叶柯进行代谢产物分析和转录分析,从不同部位转录组数据中筛选根皮苷途径关键双键还原酶基因。使用分子克隆技术获得全长后,通过无缝拼接技Benign pathologies of the oral mucosa术构建酵母表达载体,转入前期构建的根皮素底盘菌株进行功能研究。最后,使用CRIPSR-Cas9技术将筛选得到的优势双键还原酶基因与不同来源的糖基转移酶基因整合至根皮素底盘菌中,发酵后提取产物检测,获得具有一定产量的根皮苷酵母菌株。结果:1.本论文以酿酒酵母为底盘,以实验室前期构建的高产类黄酮前体对-香豆酸(ρ-HCA)的底盘菌株QL11为基础,选择来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的4-香豆酰辅酶A连接酶编码基因At4CL和来源于向日葵(Helianthus annuus)的查耳酮合成酶编码基因HeaCHS,经过经密码子优化在酿酒酵母中实现根皮素合成关键基因的异源表达,成功构建了产根皮素的酿酒酵母工程菌株LLS1,根皮素产量为1.50 mg/L,柚皮素查尔酮产量为1.25 mg/L。随后,利用CRISPR-Cas9技术分别选取组成型启动子PTDH3、PPGK1和诱导型启动子PGAL1、PGAL10对工程菌的启动子元件进行改造,经摇瓶发酵筛选后成功筛选到一株性能优良酵母工程菌LLS2,根皮素产量为2.33 mg/L,柚皮素查尔酮产量为1.13 m/L。2.据报道木姜叶柯Lithocarpus(Hance)Chun.中根皮苷含量较高,本研究对木姜叶柯不同部位进行了化学成分的检测,对根皮苷及其生物合成途径相关化合物进行了定量分析。通过UPLC-Q-tof-MS检测到根皮苷主要富集于木姜叶柯的成熟叶片中,该样品嫩叶中根皮苷的含量为9.2 mg/g,老叶中根皮苷的含量为15.7 mg/g,茎中根皮苷的含量为14.2 mg/g,根中根皮苷的含量为8.0 mg/g。3.本研究通过转录组数据分析,筛选了 10个木姜叶柯中与黄酮类化合物积累模式一致的上游途径关键DBR基因。克隆全长并构建酵母表达载体在前期构建的根皮素工程酵母菌株中进行功能研究。菌株XYX2产根皮素的量为5.63 mg/L,菌株XYX2-L i33822产根皮素6.54 mg/L,根皮素产量较未转入脱氢酶菌株显著提高至1.16倍。鉴定筛选得到的Li33822基因为在酵母中能够介导脱氢反应的双键还原酶基因。4.将菌株LLS2进行改造,整合了来源于苹果的双键还原酶MdDBR基因,成功的构建了新的菌株LLS3,根皮素的产量为14.50 mg/L。最后通过筛选来源于苹果的MdP2’GT基因和木姜叶柯的LiUGT基因构建产根皮苷的菌株,使用CRISPR-Cas9技术构建到酵母染色体上,调控代谢平衡,获得具有一定产量的根RP56976价格皮苷酵母菌株。菌株LLS4产根皮苷的量为13.09 mg/L,菌株LLS5产根皮苷的量为4.19 mg/L。结论:1.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,通过密码子优化、启动子筛选等研究策略,整合根皮素途径,能够获得产量达到2.33 mg/L的根皮素酵母工程菌,诱导型启动子能够增强4CL和CHS的表达,提升工程酵母中根皮素产量。2.木姜叶柯不同组织部位的根皮苷含量存在差异,从不同部位的转录组中筛选在叶中高表达的基因,可以通过功能研究获得根皮苷途径的高效催化元件。双键还原酶DBR(Double bond reductase)基因是黄酮途径中二氢查耳酮途径转变为根皮苷途径的关键酶基因,本研究筛选并在酵母工程菌中研究了 10个DBR基因功能,33822和64027是木姜叶柯中的介导根皮素途径双键还原反应的DBR基因,应用33822基因元件能够使工程酵母中根皮素产量显著升高1.16倍。3.运用CRISPR-Cas9技术整合苹果的双键还原酶基因MdDBR,分别整合来源于苹果的糖基转移酶基因MdP2’GT和木姜叶柯的糖基转移酶基因LiUGT,获得的根皮苷酵母工程菌最高产量可达到13.09 mg/L,为高产根皮苷酵母工程菌的改造奠定基础。